论文目录 | |
| 致谢 | 第1-11页 |
| 缩略词 | 第11-15页 |
| 摘要 | 第15-17页 |
| Abstract | 第17-19页 |
| 前言 | 第19-21页 |
| 1 文献综述：植物microRNA作用机制、生物学功能和研究方法 | 第21-39页 |
| 1.1 植物microRNA | 第22-26页 |
| 1.1.1 植物microRNA的发现 | 第22页 |
| 1.1.2 植物microRNA的生物合成 | 第22-23页 |
| 1.1.3 植物microRNA的作用机制 | 第23-24页 |
| 1.1.4 植物microRNA的特点 | 第24-25页 |
| 1.1.5 植物microRNA的预测和鉴定 | 第25-26页 |
| 1.1.6 植物microRNA靶基因的预测和鉴定 | 第26页 |
| 1.2 植物microRNA的生物学功能 | 第26-30页 |
| 1.2.1 microRNA在植物的生长发育过程中具有重要作用 | 第26-28页 |
| 1.2.1.1 miR156 | 第27页 |
| 1.2.1.2 miR159/319 | 第27页 |
| 1.2.1.3 miR165/166 | 第27-28页 |
| 1.2.1.4 miR172 | 第28页 |
| 1.2.1.5 其它miRNA | 第28页 |
| 1.2.2 microRNA参与多种植物激素信号传递过程 | 第28页 |
| 1.2.3 microRNA在环境胁迫中的作用 | 第28-30页 |
| 1.3 植物microRNA参与花粉发育过程研究进展 | 第30-32页 |
| 1.4 植物microRNA的研究方法 | 第32-39页 |
| 1.4.1 microRNA的分离和克隆方法 | 第32-33页 |
| 1.4.2 microRNA的表达的分析方法 | 第33-37页 |
| 1.4.2.1 miroRNA荧光定量PCR | 第33-34页 |
| 1.4.2.2 Northern杂交 | 第34-35页 |
| 1.4.2.3 原位杂交 | 第35页 |
| 1.4.2.4 基因芯片 | 第35页 |
| 1.4.2.5 高通量测序技术 | 第35-37页 |
| 1.4.3 microRNA靶基因的实验验证 | 第37-38页 |
| 1.4.3.1 5'modified RACE | 第37页 |
| 1.4.3.2 降解组测序 | 第37-38页 |
| 1.4.4 microRNA的功能分析方法 | 第38-39页 |
| 2 利用microRNA芯片分析白菜花粉发育相关microRNA的表达 | 第39-55页 |
| 2.1 材料与方法 | 第39-45页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第39-40页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第40页 |
| 2.1.3 植物microRNA芯片实验 | 第40页 |
| 2.1.3.1 芯片探针的设计 | 第40页 |
| 2.1.3.2 microRNA芯片实验过程 | 第40页 |
| 2.1.3.3 图像获得和数据处理 | 第40页 |
| 2.1.4 microRNA的预测 | 第40-41页 |
| 2.1.5 microRNA靶基因的预测 | 第41页 |
| 2.1.6 植物总RNA的提取 | 第41-42页 |
| 2.1.7 运用5’modified RACE验证microRNA靶基因 | 第42-43页 |
| 2.1.8 microRNA的poly(A)加尾反应和反转录反应 | 第43-44页 |
| 2.1.9 microRNA的qRT-PCR分析 | 第44-45页 |
| 2.2 结果 | 第45-52页 |
| 2.2.1 白菜‘Bcajh97-01A/B’的不育株系和可育株系花序中差异表达的microRNA | 第45页 |
| 2.2.2 预测获得白菜3个microRNA家族的13个成员 | 第45页 |
| 2.2.3 预测获得白菜3个microRNA家族的22个潜在靶基因 | 第45-46页 |
| 2.2.4 验证获得白菜3个microRNA家族的8个靶基因 | 第46-47页 |
| 2.2.5 白菜花粉发育相关microRNA的qRT-PCR分析 | 第47-52页 |
| 2.3 讨论 | 第52-55页 |
| 3 利用高通量测序筛选白菜花粉发育相关microRNA | 第55-73页 |
| 3.1 材料与方法 | 第55-59页 |
| 3.1.1 植物材料 | 第55-56页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第56页 |
| 3.1.3 microRNA的qRT-PCR分析 | 第56-57页 |
| 3.1.4 microRNA的高通量测序 | 第57-59页 |
| 3.1.4.1 小RNA库构建 | 第57页 |
| 3.1.4.2 深度测序 | 第57页 |
| 3.1.4.3 基本数据分析 | 第57-58页 |
| 3.1.4.4 白菜中植物保守的microRNA和新的microRNA的预测和鉴定 | 第58-59页 |
| 3.2 结果 | 第59-70页 |
| 3.2.1 白菜小RNA高通量测序基本数据的获得 | 第59-60页 |
| 3.2.2 白菜小RNA的长度分布统计和可比对序列的分类 | 第60-61页 |
| 3.2.3 获得白菜24个已知microRNA | 第61-63页 |
| 3.2.4 获得白菜15个microRNA家族的54条植物保守的microRNA | 第63页 |
| 3.2.5 发现白菜3个已知microRNA家族的6个新成员 | 第63-66页 |
| 3.2.6 发现白菜25对新的microRNA | 第66-68页 |
| 3.2.7 鉴定获得白菜‘Bcajh97-01A’和‘Bcajh97-01B’花蕾中18个差异表达microRNA | 第68-70页 |
| 3.3 讨论 | 第70-73页 |
| 3.3.1 小RNA高通量测序数据中存在大量无法分析数据的原因 | 第70-71页 |
| 3.3.2 白菜microRNA的发现和鉴定 | 第71-72页 |
| 3.3.3 白菜雄性不育株系和可育株系花蕾差异表达microRNA可能参与花粉发育过程 | 第72-73页 |
| 4 利用降解组测序技术分析白菜microRNA靶基因 | 第73-89页 |
| 4.1 材料与方法 | 第73-78页 |
| 4.1.1 植物材料 | 第73页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第73-74页 |
| 4.1.3 利用降解组测序鉴定microRNA靶基因 | 第74-77页 |
| 4.1.3.1 降解组文库的构建 | 第74页 |
| 4.1.3.2 深度测序 | 第74-75页 |
| 4.1.3.3 数据分析 | 第75-77页 |
| 4.1.4 利用生物信息学方法进行microRNA靶基因的预测 | 第77页 |
| 4.1.5 运用5’modified RACE验证microRNA靶基因 | 第77-78页 |
| 4.2 结果 | 第78-85页 |
| 4.2.1 白菜降解组测序基本数据分析 | 第78页 |
| 4.2.2 利用降解组测序获得白菜9个microRNA家族的18个靶基因 | 第78-84页 |
| 4.2.3 利用5’modified RACE验证获得白菜2个microRNA的3个靶基因 | 第84-85页 |
| 4.3 讨论 | 第85-89页 |
| 4.3.1 降解组测序是寻找和验证microRNA靶基因的一种高效且准确的方法 | 第85-86页 |
| 4.3.2 利用降解组测序获得的18个靶基因中大多数参与植物重要的生长发育过程 | 第86-89页 |
| 5 白菜花粉发育相关基因MIR158的功能鉴定 | 第89-117页 |
| 5.1 材料与方法 | 第90-101页 |
| 5.1.1 植物材料 | 第90页 |
| 5.1.2 主要试剂 | 第90页 |
| 5.1.3 植物DNA、总RNA提取 | 第90-92页 |
| 5.1.3.1 植物基因组DNA的提取 | 第90-91页 |
| 5.1.3.2 Trizol法制备样品总RNA | 第91-92页 |
| 5.1.4 microRNA的poly(A)加尾反应和反转录反应及qRT-PCR分析 | 第92页 |
| 5.1.5 长链mRNA的cDNA合成和qRT-PCR分析 | 第92-93页 |
| 5.1.5.1 长链mRNA的cDNA合成 | 第92页 |
| 5.1.5.2 qRT-PCR分析 | 第92-93页 |
| 5.1.6 过表达载体的构建 | 第93-94页 |
| 5.1.6.1 过表达基因片段的分离 | 第93页 |
| 5.1.6.2 过表达载体的构建 | 第93-94页 |
| 5.1.7 过表达载体对菜心的遗传转化 | 第94-96页 |
| 5.1.7.1 实验材料和菌种 | 第94页 |
| 5.1.7.2 菜心的遗传转化 | 第94-96页 |
| 5.1.8 转基因植株的分子检测 | 第96页 |
| 5.1.8.1 MIR158过表达转基因植株基因组DNA和总RNA的提取 | 第96页 |
| 5.1.8.2 MIR158过表达转基因植株的PCR检测 | 第96页 |
| 5.1.8.3 MIR158过表达转基因植株中MIR158和Bra027656表达水平的qRT-PCR分析 | 第96页 |
| 5.1.9 转基因植株的形态与细胞学观察 | 第96-97页 |
| 5.1.9.1 转基因植株的形态观察 | 第96页 |
| 5.1.9.2 花粉活力观察 | 第96-97页 |
| 5.1.9.3 花粉扫描电镜 | 第97页 |
| 5.1.9.4 花粉体外萌发试验 | 第97页 |
| 5.1.9.5 观察花粉在雌蕊中的生长情况 | 第97页 |
| 5.1.10 Bra027656启动子序列的扩增 | 第97-98页 |
| 5.1.11 Bra027656启动子表达载体的构建 | 第98-99页 |
| 5.1.11.1 入门载体的构建 | 第98页 |
| 5.1.11.2 置换反应 | 第98-99页 |
| 5.1.12 启动子表达载体的瞬时表达 | 第99-100页 |
| 5.1.13 利用浸花法将Bra027656启动子表达载体转化拟南芥及后期筛选 | 第100-101页 |
| 5.2 结果 | 第101-112页 |
| 5.2.1 白菜miR158的组织特异性表达 | 第101页 |
| 5.2.2 白菜miR158的靶基因Bra027656的组织特异性表达 | 第101页 |
| 5.2.3 白菜MIR158过表达载体的构建及对农杆菌的转化 | 第101-104页 |
| 5.2.3.1 白菜MIR158基因前体序列的获得 | 第101-102页 |
| 5.2.3.2 构建获得MIR158过表达载体 | 第102-103页 |
| 5.2.3.3 p35S∷MIRl58质粒成功转入根癌农杆菌 | 第103-104页 |
| 5.2.4 获得MIR158过表达载体转化菜心植株 | 第104页 |
| 5.2.5 MIR158过表达转基因植株的分子检测 | 第104-107页 |
| 5.2.5.1 PCR检测初步证实MIR158过表达片段成功转入菜心植株 | 第104-105页 |
| 5.2.5.2 MIR158过表达转基因菜心植株中miR158和Bra027656的qRT-PCR分析 | 第105-107页 |
| 5.2.6 MIR158过表达转基因菜心植株的形态与细胞学观察 | 第107-110页 |
| 5.2.6.1 MIR158过表达转基因菜心花粉活力降低,花粉体外萌发率降低 | 第107-109页 |
| 5.2.6.2 MIR158过表达转基因菜心花粉体内萌发率降低 | 第109页 |
| 5.2.6.3 MIR158过表达转基因菜心花粉发育畸形 | 第109-110页 |
| 5.2.7 miR158靶基因Bra027656启动子表达载体的构建 | 第110-111页 |
| 5.2.8 Bra027656启动子表达载体在洋葱表皮细胞中的瞬时表达 | 第111-112页 |
| 5.2.9 白菜Bra027656基因编码一个功能未知的P亚家族的PPR蛋白 | 第112页 |
| 5.3 讨论 | 第112-117页 |
| 5.3.1 MIR158在菜心植株中的过量表达影响花粉的正常发育 | 第112-115页 |
| 5.3.2 Bra027656编码一个非典型的PPR蛋白,它可能参与花粉发育早期的调控 | 第115-117页 |
| 结论 | 第117-119页 |
| 参考文献 | 第119-127页 |
| 附表 | 第127-139页 |
| 在读期间发表的论文 | 第139页 |
