论文目录 | |
| 致谢 | 第1-9页 |
| 摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-13页 |
| 缩略词表 | 第13-20页 |
| 1 文献综述 | 第20-54页 |
| 1.1 转基因植物的安全性 | 第20-27页 |
| 1.1.1 转基因植物的环境安全性 | 第21-25页 |
| 1.1.1.1 自身杂草化问题 | 第21-22页 |
| 1.1.1.2 抗病毒转基因植物可能潜在的生态风险 | 第22-23页 |
| 1.1.1.3 基因漂移对近缘物种潜在的威胁 | 第23-24页 |
| 1.1.1.4 外源基因对非靶标生物的影响 | 第24-25页 |
| 1.1.1.5 对生物多样性的影响 | 第25页 |
| 1.1.2 转基因植物的食用安全性 | 第25-27页 |
| 1.1.2.1 营养品质可能改变 | 第26页 |
| 1.1.2.2 毒性问题 | 第26-27页 |
| 1.2.2.3 过敏问题 | 第27页 |
| 1.2.2.4 抗生素标记基因产生的影响 | 第27页 |
| 1.2 转基因植物安全控制的生物学手段 | 第27-39页 |
| 1.2.1 解决转基因植物环境安全性问题的分子策略 | 第28-34页 |
| 1.2.1.1 叶绿体转基因技术 | 第28-29页 |
| 1.2.1.2 雄性不育法 | 第29-30页 |
| 1.2.1.3 种子不育或无籽技术 | 第30-32页 |
| 1.2.1.4 闭花受精和无融合生殖法 | 第32-33页 |
| 1.2.1.5 基因组不相容性 | 第33页 |
| 1.2.1.6 转基因缓和 | 第33-34页 |
| 1.2.1.7 外源基因删除法 | 第34页 |
| 1.2.2 常用检测转基因食品的方法 | 第34-39页 |
| 1.2.2.1 PCR技术 | 第35-36页 |
| 1.2.2.2 Southern杂交法 | 第36页 |
| 1.2.2.3 Nouthern杂交法 | 第36-37页 |
| 1.2.2.4 Western杂交法 | 第37页 |
| 1.2.2.5 酶联免疫吸附试验法(ELISA) | 第37-38页 |
| 1.2.2.6 生物芯片技术 | 第38-39页 |
| 1.3 苯达松 | 第39-41页 |
| 1.3.1 苯达松的作用机理 | 第40-41页 |
| 1.3.2 水稻苯达松解毒酶CYP81A6基因 | 第41页 |
| 1.4 红色荧光蛋白的研究及应用进展 | 第41-44页 |
| 1.4.1 红色荧光蛋白的研究进展 | 第41-43页 |
| 1.4.2 红色荧光蛋白在转基因植物上的应用进展 | 第43-44页 |
| 1.5 植物生物反应器 | 第44-46页 |
| 1.5.1 植物生物反应器的研究进展 | 第45-46页 |
| 1.5.2 植物生物反应器的安全性 | 第46页 |
| 1.6 胰岛素及其在基因工程上的研究进展 | 第46-50页 |
| 1.6.1 胰岛素 | 第47-48页 |
| 1.6.2 胰岛素在基因工程上的研究进展 | 第48-50页 |
| 1.7 依那西普 | 第50-51页 |
| 1.8 本研究的目的和意义 | 第51-54页 |
| 2 材料和方法 | 第54-70页 |
| 2.1 材料 | 第54-55页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第54页 |
| 2.1.2 常用实验菌株及载体 | 第54页 |
| 2.1.3 主要工具酶 | 第54页 |
| 2.1.4 常用试剂、核酸、蛋白分子质量及试剂盒 | 第54页 |
| 2.1.5 各种培养基的配置 | 第54页 |
| 2.1.6 常用生化试剂和仪器 | 第54-55页 |
| 2.2 论文中用到的分子生物学实验方法 | 第55-70页 |
| 2.2.1 PCR技术 | 第55-56页 |
| 2.2.2 DNA琼脂糖凝胶电泳 | 第56页 |
| 2.2.3 凝胶回收 | 第56-57页 |
| 2.2.4 高保真酶扩增产物加A反应 | 第57-58页 |
| 2.2.5 连接反应 | 第58-59页 |
| 2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第59-60页 |
| 2.2.7 重组质粒的提取 | 第60页 |
| 2.2.8 酶切反应 | 第60-61页 |
| 2.2.9 菌株保存 | 第61页 |
| 2.2.10 农杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第61-62页 |
| 2.2.11 原核表达 | 第62-63页 |
| 2.2.12 植物基因组DNA的提取(CTAB法) | 第63-64页 |
| 2.2.13 Western blot | 第64-65页 |
| 2.2.14 Southern blot | 第65-67页 |
| 2.2.15 植物总RNA提取、纯化和cDNA第一链的合成 | 第67-69页 |
| 2.2.16 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) | 第69-70页 |
| 3 内置双重安全控制机制的水稻生物反应器表达人胰岛素原 | 第70-102页 |
| 3.1 方法 | 第70-81页 |
| 3.1.1 远红荧光蛋白与人胰岛素原融合基因的原核表达 | 第70-71页 |
| 3.1.1.1 目的基因的合成 | 第70页 |
| 3.1.1.2 大肠杆菌原核表达载体的构建 | 第70-71页 |
| 3.1.1.3 原核表达 | 第71页 |
| 3.1.2 水稻转化载体的构建 | 第71-77页 |
| 3.1.3 根癌农杆菌介导的水稻遗传转化 | 第77-79页 |
| 3.1.4 转基因水稻的鉴定与分析 | 第79-81页 |
| 3.1.4.1 转基因水稻的PCR鉴定 | 第79-80页 |
| 3.1.4.2 分析mKate~(S58A)和Lem2基因在转基因水稻中的表达情况 | 第80页 |
| 3.1.4.3 Western blot方法分析人胰岛素原的表达 | 第80页 |
| 3.1.4.4 Southern blot方法鉴定目的基因的拷贝数 | 第80页 |
| 3.1.4.5 qRT-PCR分析苯达松解毒酶基因的沉默效率 | 第80-81页 |
| 3.1.5 转基因水稻对苯达松敏感性及抗草甘膦性能测定 | 第81页 |
| 3.2 结果与分析 | 第81-96页 |
| 3.2.1 原核表达结果 | 第82-83页 |
| 3.2.1.1 原核表达载体的鉴定 | 第82页 |
| 3.2.1.2 原核表达结果与分析 | 第82-83页 |
| 3.2.2 水稻转化载体的鉴定 | 第83-86页 |
| 3.2.3 转基因水稻的获得 | 第86-87页 |
| 3.2.4 转基因水稻的PCR鉴定 | 第87-89页 |
| 3.2.5 目的基因在转基因水稻中的表达情况 | 第89-93页 |
| 3.2.5.1 远红荧光蛋白基因在转基因水稻中的表达分析 | 第89-91页 |
| 3.2.5.2 Lem2基因在转基因水稻中的表达分析 | 第91-92页 |
| 3.2.5.3 Western blot方法分析人胰岛素原的表达 | 第92-93页 |
| 3.2.6 转基因水稻对除草剂的敏感性 | 第93-94页 |
| 3.2.7 苯达松解毒酶基因CYP81A6的表达差异 | 第94-96页 |
| 3.2.8 外源基因与植物基因组整合的Southern blot分析 | 第96页 |
| 3.3 小结与讨论 | 第96-102页 |
| 4 利用可选择性杀灭水稻表达依那西普的研发 | 第102-112页 |
| 4.1 方法 | 第102-105页 |
| 4.1.1 水稻转化载体的构建 | 第102-104页 |
| 4.1.1.1 依那西普基因的合成 | 第102页 |
| 4.1.1.2 构建表达依那西普的水稻转化载体 | 第102-104页 |
| 4.1.2 根癌农杆菌介导的水稻遗传转化 | 第104页 |
| 4.1.3 转化Enbrel基因水稻的鉴定与分析 | 第104-105页 |
| 4.1.3.1 PCR法鉴定目的基因Enbrel | 第104页 |
| 4.1.3.2 分析依那西普蛋白在转基因水稻中的表达情况 | 第104页 |
| 4.1.3.3 Southern blot方法鉴定Enbrel基因的拷贝数 | 第104-105页 |
| 4.1.4 转基因水稻对苯达松的敏感性测定 | 第105页 |
| 4.2 结果与分析 | 第105-110页 |
| 4.2.1 水稻转化载体的鉴定 | 第105-106页 |
| 4.2.2 转基因水稻的获得 | 第106页 |
| 4.2.3 外源基因与水稻基因组的整合 | 第106-107页 |
| 4.2.4 目的基因在转基因水稻中表达情况分析 | 第107-108页 |
| 4.2.4.1 表达依那西普的水稻种子与非转基因水稻种子形态比较 | 第107页 |
| 4.2.4.2 Western blot方法分析依那西普蛋白的表达 | 第107-108页 |
| 4.2.5 转基因水稻对除草剂敏感性分析 | 第108-109页 |
| 4.2.6 转化Enbrel基因水稻的Southern印迹分析 | 第109-110页 |
| 4.3 小结与讨论 | 第110-112页 |
| 5 全文总结 | 第112-116页 |
| 5.1 总讨论 | 第112-114页 |
| 5.1.1 内置双重安全控制机制的水稻生物反应器表达人胰岛素原 | 第112-114页 |
| 5.1.2 利用可选择性杀灭水稻表达依那西普的研发 | 第114页 |
| 5.2 创新之处 | 第114-115页 |
| 5.3 下一步的研究 | 第115-116页 |
| 参考文献 | 第116-131页 |
| 附录A 各种培养基配方 | 第131-136页 |
| 附录B 主要生化试剂和仪器 | 第136-137页 |
| 作者简介 | 第137页 |
