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中国番茄黄化曲叶病毒卫星DNA抑制转录后基因沉默的机理研究

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中国番茄黄化曲叶病毒卫星DNA抑制转录后基因沉默的机理研究
论文目录
 
致谢第1-7页
摘要第7-9页
Abstract第9-20页
1 研究背景第20-65页
  1.1 双生病毒的发生与危害第20-22页
  1.2 菜豆金色花叶病毒属病毒的分类地位及基本特性第22-26页
  1.3 菜豆金色花叶病毒属病毒伴随卫星DNAβ的研究进展第26-32页
    1.3.1 DNAβ的基因组结构第26页
    1.3.2 DNAβ参与病毒症状的诱导第26-28页
    1.3.3 DNAβ参与PTGS的抑制第28-29页
    1.3.4 DNAβ参与TGS的抑制第29-30页
    1.3.5 DNAβ参与病毒的运动第30-31页
    1.3.6 DNAβ参与寄主防卫反应的抑制第31-32页
  1.4 RNA沉默与双生病毒第32-63页
    1.4.1 RNA沉默的基本机理第33-36页
    1.4.2 参与抗病毒的RNA沉默途径中的核心蛋白第36-44页
    1.4.3 病毒诱发的RNA沉默与编码的RNA沉默抑制子第44-51页
    1.4.4 双生病毒诱发的RNA沉默第51-55页
    1.4.5 双生病毒编码的RNA沉默抑制子第55-63页
  1.5 本项目的研究目的和意义第63-65页
2 实验方法第65-91页
  2.1 常规DNA克隆技术第65-72页
    2.1.1 PCR技术第65-68页
    2.1.2 PCR产物的纯化第68页
    2.1.3 载体的去磷酸化第68页
    2.1.4 连接第68页
    2.1.5 感受态细胞的制备第68-70页
    2.1.6 转化第70页
    2.1.7 菌落PCR筛选第70-71页
    2.1.8 重组质粒的提取第71页
    2.1.9 重组克隆的酶切鉴定第71-72页
    2.1.10 重组克隆的测序鉴定第72页
  2.2 重组质粒导入根癌农杆菌及农杆菌介导的植物接种第72-73页
    2.2.1 根癌农杆菌感受态细胞的制备第72页
    2.2.2 重组质粒电击转化根癌农杆菌第72-73页
    2.2.3 农杆菌的浸润及接种第73页
  2.3 烟草的遗传转化第73-75页
    2.3.1 农杆菌的培养第73-74页
    2.3.2 烟草叶片的准备第74页
    2.3.3 预培养第74页
    2.3.4 农杆菌的侵染第74页
    2.3.5 分化培养第74-75页
    2.3.6 生根培养第75页
  2.4 植物总DNA提取以及Southern blot分析第75-80页
    2.4.1 大量抽提植物DNA的方法(CTAB法)第75-77页
    2.4.2 小量抽提植物DNA的方法(CTAB法)第77页
    2.4.3 小量抽提植物DNA的方法(试剂盒法)第77-78页
    2.4.4 Southern印迹分析第78-80页
  2.5 植物总RNA小量提取、RT-PCR及RT-qPCR第80-82页
    2.5.1 植物总RNA的小量提取步骤第80-81页
    2.5.2 反转录RT-PCR及RT-qPCR第81-82页
  2.6 Northern印迹杂交第82-86页
    2.6.1 mRNA的Northern印迹杂交第82-84页
    2.6.2 小RNA的分离及Northern blot第84-86页
  2.7 原核蛋白的表达及纯化第86-88页
    2.7.1 原核蛋白的表达第86-87页
    2.7.2 原核蛋白的纯化第87-88页
  2.8 植物总蛋白的提取、蛋白的SDS-PAGE及Western blot杂交第88-89页
    2.8.1 植物总蛋白的提取第88页
    2.8.2 蛋白的SDS-PAGE及Western blot杂交第88-89页
  2.9 亲和层析法纯化血清中的抗体第89-91页
    2.9.1 亲和柱的制备第89-90页
    2.9.2 抗体的纯化第90-91页
3 βC1上调本氏烟钙调素类似蛋白rgs-CaMs的研究第91-113页
  3.1 材料与方法第92-102页
    3.1.1 材料第92-93页
    3.1.2 载体构建第93-94页
    3.1.3 农杆菌介导的浸润及病毒的接种第94-95页
    3.1.4 转基因阳性植株的筛选与病毒侵染性的检测第95页
    3.1.5 烟草Microarray基因表达谱的制备及分析第95页
    3.1.6 本氏烟转录组的高通量测序第95-96页
    3.1.7 Northern blot及RT-qPCR的分析第96页
    3.1.8 酵母转化第96-102页
  3.2 结果与分析第102-111页
    3.2.1 卫星DNAβ编码的βC1蛋白能够诱导rgs-CaMs的表达第102-104页
    3.2.2 rgs-CaMs基因的序列分析第104-105页
    3.2.3 Nbrgs-CaM亚细胞定位及组织特异性表达分析第105-108页
    3.2.4 Nbrgs-CaM的转录激活作用分析第108-110页
    3.2.5 Nbrgs-CaM蛋白的纯化与多克隆抗体的制备第110-111页
  3.3 讨论第111-113页
4 βC1与rgs-CaMs抑制RNA沉默的特性研究第113-132页
  4.1 材料与方法第113-120页
    4.1.1 材料第113-114页
    4.1.2 载体构建第114-115页
    4.1.3 农杆菌介导的浸润及接种第115页
    4.1.4 GFP荧光记录与样品采集第115页
    4.1.5 检测病毒侵染性及VIGS的效率第115-116页
    4.1.6 植物RNA与蛋白的杂交分析第116-120页
  4.2 结果与分析第120-129页
    4.2.1 Rgs-CaMs是内源的PTGS抑制子第120-121页
    4.2.2 Nbrgs-CaM能够抑制双生病毒诱导的内源基因沉默第121-123页
    4.2.3 Nbrgs-CaM与βC1抑制PTGS中dsRNA的产生第123-125页
    4.2.4 Ntrgs-CaM与Slrgs-CaM抑制PTGS中dsRNA的产生第125-127页
    4.2.5 Nbrgs-CaM对于βc1的RNA沉默抑制活性是必需的第127-129页
  4.3 讨论第129-132页
5 Rgs-CaMs对βC1介导双生病毒致病性的研究第132-149页
  5.1 材料与方法第132-140页
    5.1.1 材料第132-133页
    5.1.2 载体构建第133-134页
    5.1.3 农杆菌介导的浸润及病毒的接种第134页
    5.1.4 转基因阳性植株的筛选第134-135页
    5.1.5 病毒侵染性的检测第135页
    5.1.6 Northern blot及RT-qPCR的分析第135页
    5.1.7 Western blot分析第135页
    5.1.8 Southern blot分析第135-140页
  5.2 结果与分析第140-147页
    5.2.1 Nbrgs-CaM转基因植株的表型分析第140-141页
    5.2.2 Nbrgs-CaM在βC1症状诱导中的功能第141-142页
    5.2.3 Rgs-CaMs对双生病毒致病性的影响第142-145页
    5.2.4 Nbrgs-CaM对CMV致病性的影响第145-147页
  5.4 讨论第147-149页
6 Nbrgs-CaM抑制RDR6介导的RNA沉默对双生病毒的抗性分析第149-168页
  6.1 材料与方法第149-156页
    6.1.1 材料第149-150页
    6.1.2 pPVX-Nbrgs-CaM载体构建第150页
    6.1.3 农杆菌介导的浸润及接种第150页
    6.1.4 GFP荧光记录与样品采集第150-151页
    6.1.5 病毒侵染性及VIGS效率的检测第151页
    6.1.6 RNA与蛋白的杂交分析第151-156页
  6.2 结果与分析第156-167页
    6.2.1 Nbrgs-CaM与βC1能够抑制NbRDR6的表达第156-158页
    6.2.2 Nbrgs-CaM对于βC1抑制NbRDR6是必需的第158页
    6.2.3 Nbrgs-CaM过表达与NbRDR6沉默的植株均能抑制S-PTGS第158-161页
    6.2.4 NbRDR6参与双生病毒诱导的RNA沉默第161-163页
    6.2.5 NbRDR6介导抗双生病毒的RNA沉默反应第163-164页
    6.2.6 RDR6限制了双生病毒的寄主范围第164-167页
  6.3 讨论第167-168页
7 Nbrgs-CaM影响SGS3介导的RNA沉默对双生病毒的抗性分析第168-201页
  7.1 材料与方法第169-177页
    7.1.1 材料第169-170页
    7.1.2 载体的构建第170-171页
    7.1.3 农杆菌介导的浸润及接种第171-172页
    7.1.4 GFP荧光记录与样品采集第172页
    7.1.5 检测病毒侵染性及VIGS的效率第172页
    7.1.6 Western blot分析NbSGS3蛋白的积累第172-177页
  7.2 结果与分析第177-199页
    7.2.1 NbSGS3序列分析及组织表达特异性第177-178页
    7.2.2 NbSGS3对于局部及系统S-PTGS的产生是必需的第178-180页
    7.2.3 NbSGS3对于系统沉默的维持是必需的第180-181页
    7.2.4 NbSGS3协同NbRDR6参与对双生病毒的抗性第181-190页
    7.2.5 Nbrgs-CaM能够与NbSGS3互作第190-193页
    7.2.6 NbSGS3的亚细胞定位分析第193-195页
    7.2.7 Nbrgs-CaM与NbSGS3能够相互影响细胞定位第195-197页
    7.2.8 Nbrgs-CaM下调NbSGS3蛋白的积累第197-199页
  7.3 讨论第199-201页
8 βC1上调Nbrgs-CaM的机理分析第201-223页
  8.1 材料与方法第201-208页
    8.1.1 材料第201-202页
    8.1.2 载体的构建第202-203页
    8.1.3 农杆菌的浸润与样品采集第203页
    8.1.4 GUS活性测定与染色分析第203-204页
    8.1.5 GFP紫外拍照、蛋白检测与活性分析第204页
    8.1.6 甲基化相关实验的方法第204-205页
    8.1.7 病毒侵染率及转基因植株的阳性筛选第205-208页
  8.2 结果与分析第208-222页
    8.2.1 βC1的核定位突变体对Nbrgs-CaM表达的影响第208-210页
    8.2.2 Nbrgs-CaM启动子的克隆第210-211页
    8.2.3 Nbrgs-CaM启动子瞬时表达的活性分析第211-213页
    8.2.4 Nbrgs-CaM启动子的甲基化分析第213-215页
    8.2.5 pC1对Nbrgs-CaM启动子甲基化的影响第215-216页
    8.2.6 Nbrgs-CaM启动子转基因的活性分析第216-218页
    8.2.7 双生病毒侵染对Nbrgs-CaM转基因启动子活性的影响第218-222页
  8.3 讨论第222-223页
9 全文小结与研究展望第223-225页
  9.1 全文小结第223-224页
  9.2 研究展望第224-225页
附文1 印度绿豆黄化花叶病毒编码AC5基因功能的鉴定与分析第225-255页
  1.1 材料与方法第225-235页
    1.1.1 材料第225-226页
    1.1.2 MYMIV侵染性克隆的构建第226-227页
    1.1.3 MYMIV AC5突变体侵染性克隆的构建第227页
    1.1.4 重组载体的构建第227-228页
    1.1.5 农杆菌的接种或者浸润第228-229页
    1.1.6 抑制子鉴定实验第229页
    1.1.7 荧光观察、拍照并采集样品第229-230页
    1.1.9 DAB染色分析第230-235页
  1.2 结果与分析第235-252页
    1.2.1 AC5的序列分析及转录起始位点的确定第235-237页
    1.2.2 AC5突变对MYMIV致病性的影响第237-239页
    1.2.3 PVX表达AC5蛋白的致病性分析第239-240页
    1.2.4 AC5基因的PTGS抑制子活性分析第240-244页
    1.2.5 AC5基因的TGS抑制子活性分析第244-246页
    1.2.6 AC5抑制PTGS的结构域的鉴定第246-247页
    1.2.7 AC5抑制TGS及致病性相关的结构域的鉴定第247-249页
    1.2.8 AC5转基因植株的分析第249-250页
    1.2.9 AC5转基因植株对MYMIV-AC5m毒力的影响第250-252页
  1.3 讨论第252-255页
附文2 番茄黄化曲叶病毒编码蛋白的致病性分析与TGS抑制子的鉴定第255-266页
  2.1 材料与方法第255-259页
    2.1.1 材料第255-256页
    2.1.2 载体构建与农杆菌浸润第256页
    2.1.3 拍照、样品采集与Western blot实验第256-259页
  2.2 结果与分析第259-264页
    2.2.1 番茄黄化曲叶病毒编码蛋白的致病性分析第259-261页
    2.2.2 番茄黄化曲叶病毒抑制TGS能力的分析第261页
    2.2.3 番茄黄化曲叶病毒编码TGS抑制子的鉴定第261-264页
  2.3 讨论第264-266页
附文3 双生病毒在酵母系统中的复制机理探讨第266-292页
  3.1 材料与方法第267-279页
    3.1.1 材料第267页
    3.1.2 载体构建第267页
    3.1.3 酵母转化第267-279页
  3.2 结果与分析第279-289页
    3.2.1 鉴定可在酵母中复制的双生病毒第279-281页
    3.2.2 酵母复制相关交体对MYMIV复制的影响第281-283页
    3.2.3 酵母突变体对Y194复制的影响第283-284页
    3.2.4 Y194复制模式的分析第284-286页
    3.2.5 Y194复制原点类似元件的鉴定第286-288页
    3.2.6 Y194中CEN元件的鉴定第288-289页
  3.3 讨论第289-292页
参考文献第292-312页
附录A 本论文所用缩写词及中英文对照第312-315页
附录B 本论文所用病毒缩写及中英文对照第315-317页
附录C 常用缓冲液及培养基配方第317-325页
作者简历及攻读博士学位期间发表的学术论文第325页

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