论文目录 | |
| 致谢 | 第1-7页 |
| 摘要 | 第7-10页 |
| ABSTRACT | 第10-19页 |
| 引言 | 第19-21页 |
| 第一章 文献综述 | 第21-41页 |
| 1.1 小麦赤霉病简介 | 第21-22页 |
| 1.2 小麦赤霉菌病的地理分布以及真菌毒素的化学型 | 第22-23页 |
| 1.3 禾谷镰孢菌的生物学特性以及侵染循环 | 第23-24页 |
| 1.4 禾谷镰孢菌侵染寄主机制研究进展 | 第24-25页 |
| 1.5 小麦赤霉病的综合防治 | 第25页 |
| 1.6 雷帕霉素的合成和临床作用机制 | 第25-32页 |
| 1.6.1 抗生素发展简史及链霉菌的生物学特性 | 第25-26页 |
| 1.6.2 雷帕霉素合成基因以及影响雷帕霉素合成的因素 | 第26-28页 |
| 1.6.3 雷帕霉素的临床效果 | 第28-29页 |
| 1.6.4 雷帕霉素作用机制的研究 | 第29-30页 |
| 1.6.5 FK506结合蛋白家族成员的生物学功能 | 第30-32页 |
| 1.7 TOR信号途径研究进展 | 第32-40页 |
| 1.7.1 酵母TOR途径探究进展 | 第32-35页 |
| 1.7.1.1 酵母中Tor蛋白的结构 | 第32-33页 |
| 1.7.1.2 酵母中Tor蛋白复合体以及功能 | 第33-35页 |
| 1.7.2 果蝇中TOR途径研究 | 第35-36页 |
| 1.7.3 拟南芥中TOR途径研究 | 第36-37页 |
| 1.7.4 哺乳动物TOR途径研究 | 第37-39页 |
| 1.7.5 丝状真菌中TOR途径研究 | 第39-40页 |
| 1.8 本研究的内容和意义 | 第40-41页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第41-68页 |
| 2.1 所用菌株和质粒 | 第41页 |
| 2.2 致病性实验寄主植物 | 第41页 |
| 2.3 实验方法 | 第41-68页 |
| 2.3.1 禾谷镰孢菌保存方法 | 第42页 |
| 2.3.2 PCR技术 | 第42页 |
| 2.3.3 DNA的琼脂糖电泳 | 第42-43页 |
| 2.3.4 PCR产物纯化 | 第43页 |
| 2.3.5 DNA克隆技术 | 第43-44页 |
| 2.3.5.1 连接反应 | 第43页 |
| 2.3.5.2 大肠杆菌转化 | 第43-44页 |
| 2.3.6 重组质粒的鉴定与提取 | 第44页 |
| 2.3.6.1 重组质粒的鉴定 | 第44页 |
| 2.3.6.2 重组质粒的提取 | 第44页 |
| 2.3.7 质粒双酶切 | 第44页 |
| 2.3.8 禾谷镰孢菌基因敲除载体和基因回补载体的构建 | 第44-46页 |
| 2.3.9 FLAG和GFP标签融合蛋白载体构建 | 第46页 |
| 2.3.10 酵母感受态的制备 | 第46页 |
| 2.3.11 酵母质粒的提取 | 第46-47页 |
| 2.3.12 FLAG标签融合蛋白载体构建 | 第47-48页 |
| 2.3.13 GFP标签融合蛋白载体构建 | 第48页 |
| 2.3.14 禾谷镰孢菌遗传转化 | 第48-49页 |
| 2.3.14.1 分生孢子的收集 | 第48-49页 |
| 2.3.14.2 幼殖体制备 | 第49页 |
| 2.3.14.3 幼殖体裂解 | 第49页 |
| 2.3.14.4 原生质体转化 | 第49页 |
| 2.3.15 禾谷镰孢菌基因组DNA的小量制备 | 第49-50页 |
| 2.3.16 禾谷镰孢菌紫外诱变 | 第50页 |
| 2.3.17 基因组DNA的大量提取(CTAB法) | 第50-51页 |
| 2.3.18 禾谷镰孢菌基因组DNA Southern blot分析 | 第51页 |
| 2.3.19 杂交样品准备 | 第51页 |
| 2.3.20 禾谷镰孢菌基因组DNA的消化、电泳及变性 | 第51-52页 |
| 2.3.21 DNA转膜 | 第52-53页 |
| 2.3.22 DNA探针的制备 | 第53页 |
| 2.3.23 预杂交和杂交 | 第53-54页 |
| 2.3.24 印迹膜的冲洗和化学发光检测信号 | 第54页 |
| 2.3.25 禾谷镰孢菌总RNA的提取以及第一链cDNA合成 | 第54-55页 |
| 2.3.25.1 禾谷镰孢菌总RNA的提取 | 第54-55页 |
| 2.3.25.2 第一链cDNA合成 | 第55页 |
| 2.3.26 生长速率测定 | 第55-56页 |
| 2.3.27 菌丝和孢子的组织学分析 | 第56页 |
| 2.3.27.1 菌丝脂肪体染色 | 第56页 |
| 2.3.27.2 菌丝、孢子细胞壁和隔膜染色 | 第56页 |
| 2.3.27.3 菌丝和孢子的细胞核染色 | 第56页 |
| 2.3.28 禾谷镰孢菌的产孢以及产子囊壳实验 | 第56页 |
| 2.3.29 禾谷镰孢菌对不同氮源、各种细胞胁迫压力、杀菌剂敏感性分析 | 第56-58页 |
| 2.3.29.1 氮源测定 | 第57页 |
| 2.3.29.2 细胞胁迫以及杀菌剂敏感性测定 | 第57-58页 |
| 2.3.30 禾谷镰孢菌麦穗致病性分析 | 第58页 |
| 2.3.31 禾谷镰孢菌DON毒素和麦角甾醇含量测定 | 第58-59页 |
| 2.3.31.1 禾谷镰孢菌DON毒素提取方法 | 第58-59页 |
| 2.3.31.2 禾谷镰孢菌DON毒素HPLC测定方法 | 第59页 |
| 2.3.32 禾谷镰孢菌麦角甾醇的提取和含量测定 | 第59-60页 |
| 2.3.32.1 禾谷镰孢菌麦角甾醇提取方法 | 第59-60页 |
| 2.3.32.2 禾谷镰孢菌麦角甾醇测定方法 | 第60页 |
| 2.3.33 酵母双杂交分析 | 第60-62页 |
| 2.3.33.1 酵母双杂载体的构建 | 第60-61页 |
| 2.3.33.2 酵母感受态细胞的制备以及质粒共转化 | 第61页 |
| 2.3.33.3 酵母转化子β-半乳糖苷酶活性检测 | 第61-62页 |
| 2.3.34 酵母回补载体的构建 | 第62页 |
| 2.3.35 Western blot印迹分析 | 第62-65页 |
| 2.3.35.1 禾谷镰孢菌总蛋白的提取以及样品处理 | 第62-63页 |
| 2.3.35.2 分离胶和浓缩胶的制备 | 第63-64页 |
| 2.3.35.3 上样电泳 | 第64页 |
| 2.3.35.4 湿法转膜 | 第64页 |
| 2.3.35.5 化学发光 | 第64-65页 |
| 2.3.36 免疫共沉淀 | 第65-66页 |
| 2.3.36.1 菌株的构建和转化 | 第65页 |
| 2.3.36.2 菌丝总蛋白提取 | 第65页 |
| 2.3.36.3 总蛋白的孵育 | 第65页 |
| 2.3.36.4 与FLAG结合的蛋白的洗脱 | 第65-66页 |
| 2.3.36.5 Western Blotting检测互作蛋白 | 第66页 |
| 2.3.37 亲和捕捉实验 | 第66-68页 |
| 2.3.37.1 总蛋白的提取 | 第66页 |
| 2.3.37.2 总蛋白的孵育 | 第66页 |
| 2.3.37.3 与FLAG结合的蛋白的洗脱 | 第66-68页 |
| 第三章 结果与分析 | 第68-110页 |
| 3.1 禾谷镰孢菌中雷帕霉素作用机制研究 | 第68-78页 |
| 3.1.1 雷帕霉素能够显著抑制禾谷镰孢菌的生长 | 第68-69页 |
| 3.1.2 雷帕霉素能够抑制禾谷镰孢菌产孢、诱导细胞自噬 | 第69-70页 |
| 3.1.3 FgFkbp12特异性地与雷帕霉素结合并介导雷帕霉素的毒性 | 第70-75页 |
| 3.1.3.1 禾谷镰孢菌中FKBP同源基因的敲除 | 第70-72页 |
| 3.1.3.2 FgFKBP12敲除突变体雷帕霉素抗性增强 | 第72-73页 |
| 3.1.3.3 ΔFgFKBP12对其他药剂敏感性无明显变化 | 第73-74页 |
| 3.1.3.4 FgFKBP12回补载体的构建以及DNA杂交分析 | 第74-75页 |
| 3.1.3.5 ΔFgFKBP12-C恢复对雷帕霉素和FK506的敏感性 | 第75页 |
| 3.1.4 FgTor是禾谷镰孢菌生长所必须的,发生点突变的FgTor(FgTor~(S1866L),FgTor~(S1866L))对雷帕霉素产生抗性 | 第75-78页 |
| 3.1.4.1 FgTor的氨基酸序列分析 | 第75-76页 |
| 3.1.4.2 FgTOR敲除载体的构建以及转化子的鉴定 | 第76-77页 |
| 3.1.4.3 发生点突变的FgTor对雷帕霉素抗性增强 | 第77页 |
| 3.1.4.4 雷帕霉素和FgFkbp12形成的复合体不能结合到点突变的FgTor上 | 第77-78页 |
| 3.2 小结 | 第78-79页 |
| 3.3 TOR途径下游元件功能研究 | 第79-108页 |
| 3.3.1 FgTAP42功能研究 | 第79-84页 |
| 3.3.1.1 FgTap42的多序列比对分析 | 第79-80页 |
| 3.3.1.2 FgTAP42的敲除载体构建以及转化子鉴定 | 第80-81页 |
| 3.3.1.3 FgTAP42能够部分恢复酵母tap42-11的表型 | 第81-82页 |
| 3.3.1.4 FgTap42在酵母和禾谷镰孢菌中的定位不同 | 第82-83页 |
| 3.3.1.5 FgTap42能够与FgKogl、FgPp2A和类Pp2A磷酸酶互作 | 第83-84页 |
| 3.3.2 FgSIT4、FgPPG1功能研究 | 第84-99页 |
| 3.3.2.1 FgPp2A、FgSit4、FgPpg1序列与酵母同源蛋白比对分析 | 第84-85页 |
| 3.3.2.2 FgPp2A、FgSit4、FgPpg1能够与FgTap42互作 | 第85-86页 |
| 3.3.2.3 FgPP2A、FgSIT4、FgPPG1均能够部分恢复酵母sit4的生长缺陷 | 第86-87页 |
| 3.3.2.4 FgPP2A、FgSIT4、FgPPG1敲除载体构建以及转化 | 第87-89页 |
| 3.3.2.5 ΔFgSIT4、ΔFgPPG1回补载体构建 | 第89页 |
| 3.3.2.6 ΔFgSIT4、ΔFgPPG1在PDA上生长缓慢 | 第89-90页 |
| 3.3.2.7 ΔFgSIT4、ΔFgPPG1菌丝脂肪体含量减少 | 第90页 |
| 3.3.2.8 ΔFgSIT4的孢子产量无显著变化、ΔFgPPG1孢子产量显著减少,但是ΔFgSIT4和ΔFgPPG1的孢子隔膜都减少 | 第90-91页 |
| 3.3.2.9 ΔFgSIT4、ΔFgPPG1的有性生殖受阻 | 第91-92页 |
| 3.3.2.10 ΔFgSIT4、ΔFgPPG1在麦穗上致病力显著降低 | 第92-93页 |
| 3.3.2.11 ΔFgSIT4、ΔFgPPG1对药剂、离子胁迫、氧化压力无明显变化 | 第93-95页 |
| 3.3.2.12 ΔFgSIT4、ΔFgPPG1对细胞壁胁迫物质敏感性增加 | 第95-96页 |
| 3.3.2.13 ΔFgSIT4、ΔFgPPG1中FgMgv1磷酸化水平下降 | 第96-97页 |
| 3.3.2.14 FgPpg1能够与FgMsg5互作 | 第97页 |
| 3.3.2.15 FgMsg5能够与FgSit4、FgPpg1和FgMgv1互作 | 第97-98页 |
| 3.3.2.16 FgMSG5敲除突变体对细胞壁胁迫物质荧光白抗性增强 | 第98-99页 |
| 3.3.3 FgTIP41功能研究 | 第99-104页 |
| 3.3.3.1 FgTIP41能够部分回补酵母TIP41敲除突变体 | 第99页 |
| 3.3.3.2 FgTIP41敲除载体构建以及转化子鉴定 | 第99-100页 |
| 3.3.3.3 ΔFgTIP41回补载体构建以及转化 | 第100页 |
| 3.3.3.4 ΔFgTIP41在PDA上生长缓慢 | 第100-101页 |
| 3.3.3.5 ΔFgTIP41在有性生殖和无性生殖方面无显著影响 | 第101-102页 |
| 3.3.3.6 ΔFgTIP41对各类药剂、金属离子、氧化胁迫明显敏感性变化 | 第102页 |
| 3.3.3.7 ΔFgTIP41在麦穗上的致病力减弱 | 第102-103页 |
| 3.3.3.8 FgTip41能够与FgPpg1互作,但是不能够与FgTap42互作 | 第103-104页 |
| 3.3.4 FgAREA功能研究 | 第104-108页 |
| 3.3.4.1 FgAREA与酵母GLN3存在功能同源 | 第104-105页 |
| 3.3.4.2 FgAREA敲除载体构建以及转化子鉴定 | 第105页 |
| 3.3.4.3 ΔFgAREA回补载体构建以及转化 | 第105-106页 |
| 3.3.4.4 ΔFgAREA在PDA上菌丝变稀疏 | 第106页 |
| 3.3.4.5 ΔFgAREA在绿豆中基本不能产孢,但是在CMC中能正常产孢 | 第106-107页 |
| 3.3.4.6 ΔFgAREA对各类药剂敏感性无变化 | 第107页 |
| 3.3.4.7 ΔFgAREA不能利用只含有硝酸盐的氮源 | 第107-108页 |
| 3.3.4.8 ΔFgAREA致病力下降 | 第108页 |
| 3.4 小结 | 第108-110页 |
| 第四章 全文总结讨论与展望 | 第110-118页 |
| 4.1 全文总结 | 第110-112页 |
| 4.2 全文讨论 | 第112-115页 |
| 4.3 后续工作设想 | 第115-118页 |
| 参考文献 | 第118-130页 |
| 附录 | 第130-149页 |
| 附录一 实验中所涉及的引物 | 第130-140页 |
| 附录二 常用的培养基、试剂和溶液配方 | 第140-148页 |
| 附录三 常用试验仪器 | 第148-149页 |
| 作者简历及攻读博士期间发表论文 | 第149页 |
