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生理工程策略提升乳酸菌γ-氨基丁酸合成效率的研究

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生理工程策略提升乳酸菌γ-氨基丁酸合成效率的研究
论文目录
 
致谢第1-8页
摘要第8-10页
ABSTRACT第10-18页
缩略语表第18-20页
第一章 文献综述第20-46页
  1.1 概述第20-22页
  1.2 国内外研究进展第22-41页
    1.2.1 GABA第22-29页
      1.2.1.1 GABA理化性质第22-23页
      1.2.1.2 GABA生理功能第23页
      1.2.1.3 GABA的应用第23-25页
      1.2.1.4 GABA在生物体内的代谢途径第25-26页
      1.2.1.5 GABA生产制备方法第26-29页
    1.2.2 乳酸菌第29-33页
      1.2.2.1 乳酸菌及其应用第29-31页
      1.2.2.2 乳酸菌所面临的环境胁迫第31页
      1.2.2.3 抵御环境酸胁迫的耐受与响应机制第31-33页
    1.2.3 乳酸菌生产GABA的研究进展第33-39页
      1.2.3.1 高产GABA乳酸菌的筛选与鉴定第34-35页
      1.2.3.2 乳酸菌GAD系统关键蛋白的酶学特性第35-36页
      1.2.3.3 乳酸菌发酵生产GABA的调控策略第36-39页
      1.2.3.4 乳酸菌遗传改造提升GABA合成效率的研究第39页
    1.2.4 生理工程策略提升乳酸菌合成GABA的理论基础第39-41页
      1.2.4.1 微生物生理工程第39-40页
      1.2.4.2 基于生理工程策略提升乳酸菌生产性能的研究第40-41页
  1.3 本论文的主要研究内容第41-46页
    1.3.1 立题依据与研究意义第41-43页
    1.3.2 本论文的主要研究思路和内容第43-46页
第二章 短乳杆菌GAD系统基因的表达调控与功能分析第46-72页
  2.1 前言第46-47页
  2.2 材料与方法第47-57页
    2.2.1 菌株和质粒第47-48页
    2.2.2 试剂和仪器第48页
      2.2.2.1 试剂第48页
      2.2.2.2 仪器第48页
    2.2.3 培养基和培养条件第48-49页
      2.2.3.1 培养基第48-49页
      2.2.3.2 发酵培养条件第49页
    2.2.4 分子生物学操作第49-55页
      2.2.4.1 细菌基因组和质粒提取第49页
      2.2.4.2 基因产物回收第49页
      2.2.4.3 短乳杆菌耐受酸胁迫途径中关键系统基因的克隆解析第49-50页
      2.2.4.4 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化第50页
      2.2.4.5 短乳杆菌感受态的制备第50-51页
      2.2.4.6 短乳杆菌电击转化第51页
      2.2.4.7 短乳杆菌基因缺失菌株的构建与筛选第51-53页
      2.2.4.8 短乳杆菌基因缺失回补菌株的构建第53页
      2.2.4.9 荧光定量PCR测定GAD系统关键基因转录第53-55页
    2.2.5 短乳杆菌酸胁迫实验第55页
    2.2.6 GAD与ADI蛋白的表达及纯化第55-56页
    2.2.7 短乳杆菌精氨酸及谷氨酸代谢特征分析第56页
    2.2.8 精氨酸、鸟氨酸和瓜氨酸含量的测定第56页
    2.2.9 GABA和谷氨酸含量的测定第56-57页
    2.2.10 菌体生物量的测定第57页
    2.2.11 菌体GAD催化活力的表征第57页
  2.3 结果与讨论第57-69页
    2.3.1 短乳杆菌电击转化方法的建立第57-58页
    2.3.2 短乳杆菌抗酸系统中关键途径基因结构及组成第58页
    2.3.3 基于基因表型的短乳杆菌抗酸机制分析第58-60页
    2.3.4 短乳杆菌GAD系统基因结构特征第60-62页
    2.3.5 短乳杆菌中gadRCB基因簇的表达受pH调控第62-64页
    2.3.6 短乳杆菌中gadB和gadC形成gadCB操纵子并共同转录表达第64-66页
    2.3.7 GadR阳性调节gadCB操纵子的表达第66-67页
    2.3.8 GadC与GadB蛋白共同赋予短乳杆菌合成GABA的性能第67-68页
    2.3.9 GAD系统是短乳杆菌抵御酸胁迫的重要途径第68-69页
  2.4 本章小结第69-72页
第三章 弱化F_lF_o-ATPASE活性促进短乳杆菌GABA的合成第72-90页
  3.1 前言第72-73页
  3.2 材料与方法第73-77页
    3.2.1 菌株和质粒第73页
    3.2.2 试剂和仪器第73-74页
      3.2.2.1 试剂第73-74页
      3.2.2.2 仪器第74页
    3.2.3 培养基和培养条件第74-75页
      3.2.3.1 培养基第74页
      3.2.3.2 发酵培养条件第74-75页
    3.2.4 短乳杆菌重组菌株的构建第75页
    3.2.5 短乳杆菌F_lF_o-ATPase缺陷菌株的选育第75-76页
    3.2.6 短乳杆菌胞内pH的测定第76页
    3.2.7 细胞膜组分的分离第76页
    3.2.8 ATPase活性分析第76-77页
    3.2.9 基于比色法的高GAD活性突变菌株高通量筛选第77页
    3.2.10 DCCD对GAD及ATPase活性的影响第77页
  3.3 结果与讨论第77-87页
    3.3.1 GAD系统关键蛋白在Lb. brevis CGMCC 1306中的重组表达第77-78页
    3.3.2 过表达GAD系统关键蛋白增强Lb. brevis CGMCC 1306细胞GAD活性第78-80页
    3.3.3 弱化F_lF_o-ATPase活性对Lb. brevis CGMCC 1306细胞GAD活性的影响第80-82页
    3.3.4 基于pH敏感指示剂比色法的高GAD活性菌株高通量筛选方法建立第82-83页
    3.3.5 F_lF_o-ATPase活性弱化Lb. brevis/pMG36e-gadA突变株的选育第83-84页
    3.3.6 典型F_lF_o-ATPase缺陷菌株中细胞内微环境的差异第84-86页
    3.3.7 典型F_lF_o-ATPase缺陷菌株GABA合成性能分析第86-87页
  3.4 本章小结第87-90页
第四章 GAD系统关键元件筛选、改造及组合提升短乳杆菌GABA合成性能第90-106页
  4.1 前言第90-91页
  4.2 材料与方法第91-96页
    4.2.1 菌株和质粒第91-92页
    4.2.2 试剂和仪器第92页
      4.2.2.1 试剂第92页
      4.2.2.2 仪器第92页
    4.2.3 培养基和培养条件第92-93页
      4.2.3.1 培养基第92-93页
      4.2.3.2 发酵培养条件第93页
    4.2.4 大肠杆菌重组菌株的构建第93页
    4.2.5 短乳杆菌重组菌株的构建第93-94页
    4.2.6 重组大肠杆菌的诱导表达第94-95页
    4.2.7 重组GAD的纯化第95页
    4.2.8 重组GAD酶学特性分析第95页
    4.2.9 短乳杆菌诱导表达第95页
    4.2.10 短乳杆菌细胞粗酶液的制备第95页
    4.2.11 菌体表观GAD活性的测定第95-96页
  4.3 结果与讨论第96-105页
    4.3.1 乳酸菌源GAD在不同pH条件下的催化特性第96-98页
    4.3.2 具有较宽pH活性范围GAD的获取及酶学性质分析第98-99页
    4.3.3 定向改造LpGAD拓宽其pH活性范围第99-100页
    4.3.4 过表达C末端截短的LpGAD突变体提升短乳杆菌GAD活性第100-102页
    4.3.5 GAD系统关键蛋白组合提升短乳杆菌催化活性第102-103页
    4.3.6 补料分批发酵条件下重组菌株GABA合成性能分析第103-105页
  4.4 本章小结第105-106页
第五章 重构乳酸菌模式菌株GAD系统强化其GABA合成性能第106-124页
  5.1 前言第106-107页
  5.2 材料与方法第107-111页
    5.2.1 菌株和质粒第107页
    5.2.2 试剂和仪器第107-108页
      5.2.2.1 试剂第107-108页
      5.2.2.2 仪器第108页
    5.2.3 培养基和培养条件第108-109页
      5.2.3.1 培养基第108页
      5.2.3.2 发酵培养条件第108-109页
    5.2.4 乳酸乳球菌感受态细胞制备第109页
    5.2.5 乳酸乳球菌感受态细胞的电击转化第109页
    5.2.6 乳酸乳球菌重组菌株的构建第109-110页
    5.2.7 重组乳酸乳球菌的诱导表达及代谢产物分析第110-111页
    5.2.8 乳酸乳球菌胞内ATP及ADP含量的测定第111页
    5.2.9 乳酸乳球菌胞内GABA含量的测定第111页
  5.3 结果与讨论第111-121页
    5.3.1 Lc. lactis subsp. lactis CV56的GAD系统基因结构及组成第111-112页
    5.3.2 过量表达GAD系统关键蛋白对乳酸乳球菌GABA合成的影响第112-114页
    5.3.3 GAD系统关键基因重排强化乳酸乳球菌GABA合成效率第114-115页
    5.3.4 拓宽重组乳酸乳球菌胞内GadB蛋白pH活性范围提升GABA合成效率第115-116页
    5.3.5 重构有氧呼吸代谢途径提升乳酸乳球菌细胞生物量第116-118页
    5.3.6 好氧条件下乳酸乳球菌GABA合成性能分析第118-119页
    5.3.7 有氧呼吸抑制乳酸乳球菌GABA的合成第119-120页
    5.3.8 重构乳酸乳球菌有氧呼吸途径益于维持其胞内近中性环境第120-121页
    5.3.9 有氧呼吸抑制乳酸乳球菌GABA合成的机理第121页
  5.4 本章小节第121-124页
第六章 构建基于乳酸乳球菌可控裂解系统提升乳酸菌混合发酵体系中GABA的合成第124-142页
  6.1 前言第124-125页
  6.2 材料与方法第125-131页
    6.2.1 菌株和质粒第125-127页
    6.2.2 试剂和仪器第127页
      6.2.2.1 试剂第127页
      6.2.2.2 仪器第127页
    6.2.3 培养基和培养条件第127-128页
      6.2.3.1 培养基第127-128页
      6.2.3.2 发酵培养条件第128页
    6.2.4 乳酸乳球菌重组菌株的构建第128-131页
    6.2.5 重组短乳杆菌诱导表达第131页
    6.2.6 重组乳酸乳球菌诱导表达第131页
    6.2.7 乳酸菌混合发酵体系的诱导表达第131页
  6.3 结果与讨论第131-141页
    6.3.1 乳酸菌自溶酶AcmA介导的乳酸乳球菌可控裂解第131-133页
    6.3.2 温和型噬菌体rlt裂解盒LytHA介导的乳酸乳球菌可控裂解第133-134页
    6.3.3 基于LytHA的乳酸乳球菌可控裂解系统提升其GABA合成效率第134-135页
    6.3.4 重组可控裂解乳酸乳球菌GABA合成性能分析第135-136页
    6.3.5 乳酸菌混合发酵体系中可控裂解系统“平台菌株”的构建第136-137页
    6.3.6 粪肠球菌细菌素EnlA介导的乳酸乳球菌可控裂解系统第137-138页
    6.3.7 基于细菌素EnlA的可控裂解系统提升乳酸乳球菌混合发酵体系GABA的合成第138-139页
    6.3.8 基于细菌素EnlA的可控裂解系统提升短乳杆菌与乳酸乳球菌混合发酵体系GABA的合成第139-141页
  6.4 本章小结第141-142页
第七章 结论与展望第142-144页
  7.1 主要结论第142-143页
  7.2 展望第143-144页
附录第144-152页
参考文献第152-170页
攻读博士学位期间的科研成果第170-172页
读博期间科研成果第170-171页
El及核心第171页
会议报告第171-172页
个人简介第172页

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