论文目录 | |
| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 英文缩写词表 | 第8-16页 |
| 第一章 绪论 | 第16-35页 |
| 1.1 抗生素的使用及危害 | 第16-20页 |
| 1.1.1 抗生素 | 第16页 |
| 1.1.2 抗生素的使用 | 第16-17页 |
| 1.1.3 抗菌作用机理 | 第17-18页 |
| 1.1.4 抗生素滥用危害 | 第18-20页 |
| 1.2 食源性耐药菌的产生及耐药机理 | 第20-23页 |
| 1.2.1 细菌耐药性的产生 | 第20-21页 |
| 1.2.2 细菌耐药机理 | 第21-23页 |
| 1.3 抗生素耐药基因的水平传播 | 第23-26页 |
| 1.3.1 整合子介导耐药基因传播 | 第23-24页 |
| 1.3.2 转座子介导耐药基因传播 | 第24-25页 |
| 1.3.3 质粒介导耐药基因传播 | 第25-26页 |
| 1.4 PCR-DGGE技术分析菌群结构 | 第26-30页 |
| 1.4.1 DGGE技术原理 | 第27-28页 |
| 1.4.2 DGGE技术的应用 | 第28-30页 |
| 1.5 宏基因组学技术在抗生素抗性基因研究中的应用 | 第30-33页 |
| 1.5.1 宏基因组学概述 | 第30页 |
| 1.5.2 宏基因组文库的构建 | 第30-32页 |
| 1.5.3 宏基因组高通量测序 | 第32-33页 |
| 1.6 本课题的研究意义及主要内容 | 第33-35页 |
| 1.6.1 研究意义 | 第33-34页 |
| 1.6.2 研究内容 | 第34-35页 |
| 第二章 养殖环境及猪肉样品中多重耐药细菌的分离与鉴定 | 第35-51页 |
| 2.1 引言 | 第35页 |
| 2.2 实验材料及设备 | 第35-38页 |
| 2.2.1 实验样品 | 第35页 |
| 2.2.2 菌株与质粒 | 第35-36页 |
| 2.2.3 主要试剂 | 第36页 |
| 2.2.4 常用培养基及溶液配制 | 第36-37页 |
| 2.2.5 主要仪器设备 | 第37-38页 |
| 2.3 技术路线图 | 第38页 |
| 2.4 实验方法 | 第38-44页 |
| 2.4.1 样品采集 | 第38-39页 |
| 2.4.2 样品前处理 | 第39-40页 |
| 2.4.3 多重耐药菌分离培养 | 第40页 |
| 2.4.4 多重耐药菌株PCR模板制备 | 第40页 |
| 2.4.5 PCR扩增多重耐药菌株 16S r DNA基因 | 第40-41页 |
| 2.4.6 PCR产物检测 | 第41-42页 |
| 2.4.7 胶回收目的片段 | 第42页 |
| 2.4.8 目的片段与T载体连接 | 第42页 |
| 2.4.9 化学感受态细胞的制备 | 第42-43页 |
| 2.4.10 重组质粒转化感受态细胞 | 第43页 |
| 2.4.11 阳性克隆子质粒提取 | 第43页 |
| 2.4.12 PCR验证 | 第43-44页 |
| 2.4.13 菌属鉴定及同源性分析 | 第44页 |
| 2.5 实验结果 | 第44-47页 |
| 2.5.1 多重耐药菌株分离 | 第44页 |
| 2.5.2 基因组DNA提取 | 第44页 |
| 2.5.3 16S rDNA基因PCR扩增 | 第44-45页 |
| 2.5.4 克隆子验证 | 第45-46页 |
| 2.5.5 多重耐药菌株菌属鉴定 | 第46-47页 |
| 2.5.6 多重耐药菌株进化树构建及同源性分析 | 第47页 |
| 2.6 讨论 | 第47-50页 |
| 2.7 本章小结 | 第50-51页 |
| 第三章 多重耐药菌株耐药性及耐药基因分析 | 第51-72页 |
| 3.1 引言 | 第51页 |
| 3.2 实验材料及设备 | 第51-54页 |
| 3.2.1 实验样品 | 第51页 |
| 3.2.2 菌株与质粒 | 第51-52页 |
| 3.2.3 耐药基因引物 | 第52页 |
| 3.2.4 主要试剂 | 第52页 |
| 3.2.5 常用培养基及溶液配制 | 第52-54页 |
| 3.2.6 主要仪器设备 | 第54页 |
| 3.3 技术路线图 | 第54页 |
| 3.4 实验方法 | 第54-58页 |
| 3.4.1 多重耐药菌株药敏实验 | 第54-55页 |
| 3.4.2 多重PCR扩增耐药基因 | 第55-56页 |
| 3.4.3 PCR扩增整合子及耐药基因盒 | 第56-57页 |
| 3.4.4 PCR产物检测 | 第57页 |
| 3.4.5 胶回收目的片段 | 第57页 |
| 3.4.6 目的片段与T载体连接 | 第57页 |
| 3.4.7 化学感受态细胞的制备 | 第57页 |
| 3.4.8 重组质粒转化感受态细胞 | 第57页 |
| 3.4.9 阳性克隆子质粒提取 | 第57页 |
| 3.4.10 PCR验证 | 第57-58页 |
| 3.4.11 目的基因序列鉴定 | 第58页 |
| 3.4.12 细菌自然接合实验 | 第58页 |
| 3.4.13 接合子筛选 | 第58页 |
| 3.4.14 接合子耐药基因盒扩增 | 第58页 |
| 3.5 实验结果 | 第58-68页 |
| 3.5.1 多重耐药菌耐药性分布 | 第58-59页 |
| 3.5.2 多重耐药菌耐药基因分布 | 第59-60页 |
| 3.5.3 多重耐药菌整合子及耐药基因盒分布 | 第60页 |
| 3.5.4 细菌自然接合转移 | 第60-68页 |
| 3.6 讨论 | 第68-70页 |
| 3.7 本章小结 | 第70-72页 |
| 第四章 DGGE分析养殖环境及猪肉样品细菌多样性 | 第72-97页 |
| 4.1 引言 | 第72页 |
| 4.2 实验材料及设备 | 第72-76页 |
| 4.2.1 实验样品 | 第72页 |
| 4.2.2 菌株与质粒 | 第72-73页 |
| 4.2.3 实验所用引物 | 第73页 |
| 4.2.4 主要试剂 | 第73页 |
| 4.2.5 常用培养基及溶液配制 | 第73-75页 |
| 4.2.6 主要仪器设备 | 第75-76页 |
| 4.3 技术路线图 | 第76页 |
| 4.4 实验方法 | 第76-81页 |
| 4.4.1 样品采集 | 第76-77页 |
| 4.4.2 细菌基因组DNA提取 | 第77页 |
| 4.4.3 PCR扩增基因组DNA 16S r DNA基因 | 第77-78页 |
| 4.4.4 PCR产物纯化 | 第78页 |
| 4.4.5 PCR扩增GC-V3区基因 | 第78页 |
| 4.4.6 DGGE检测细菌多样性 | 第78-79页 |
| 4.4.7 目的片段切胶回收 | 第79-80页 |
| 4.4.8 PCR扩增V3区基因 | 第80页 |
| 4.4.9 胶回收目的片段 | 第80页 |
| 4.4.10 目的片段与T载体连接 | 第80页 |
| 4.4.11 化学感受态细胞的制备 | 第80页 |
| 4.4.12 重组质粒转化感受态细胞 | 第80页 |
| 4.4.13 阳性克隆子质粒提取 | 第80页 |
| 4.4.14 PCR验证 | 第80-81页 |
| 4.4.15 菌属鉴定及同源性分析 | 第81页 |
| 4.5 实验结果 | 第81-91页 |
| 4.5.1 环境及猪肉样品细菌基因组DNA提取 | 第81页 |
| 4.5.2 16S rDNA基因扩增及纯化 | 第81-82页 |
| 4.5.3 DGGE电泳结果 | 第82-84页 |
| 4.5.4 目的条带回收、克隆及验证 | 第84-86页 |
| 4.5.5 菌属鉴定及多样性分析 | 第86-90页 |
| 4.5.6 进化树构建及同源性比对 | 第90-91页 |
| 4.6 讨论 | 第91-96页 |
| 4.7 本章小结 | 第96-97页 |
| 第五章 养殖环境及肉样样品中耐药基因的分布与定量研究 | 第97-130页 |
| 5.1 引言 | 第97页 |
| 5.2 实验材料及设备 | 第97-100页 |
| 5.2.1 实验样品 | 第97页 |
| 5.2.2 菌株与质粒 | 第97页 |
| 5.2.3 实验引物 | 第97-99页 |
| 5.2.4 主要试剂 | 第99页 |
| 5.2.5 常用培养基及溶液配制 | 第99页 |
| 5.2.6 主要仪器设备 | 第99-100页 |
| 5.3 技术路线图 | 第100页 |
| 5.4 实验方法 | 第100-105页 |
| 5.4.1 样品采集及前处理 | 第100页 |
| 5.4.2 样品中细菌基因组DNA提取 | 第100页 |
| 5.4.3 26 种耐药基因PCR扩增 | 第100-102页 |
| 5.4.4 PCR产物检测 | 第102页 |
| 5.4.5 10 种耐药基因Real-time PCR定量分析 | 第102-105页 |
| 5.5 实验结果 | 第105-125页 |
| 5.5.1 环境及肉样样品中耐药基因的分布 | 第105页 |
| 5.5.2 10 种耐药基因Real-time PCR定量分析 | 第105-125页 |
| 5.6 讨论 | 第125-128页 |
| 5.7 本章小结 | 第128-130页 |
| 第六章 土壤细菌DNA宏基因组测序及耐药基因分析 | 第130-169页 |
| 6.1 引言 | 第130-131页 |
| 6.2 实验材料及设备 | 第131页 |
| 6.2.1 实验样品 | 第131页 |
| 6.2.2 主要仪器设备 | 第131页 |
| 6.3 技术路线图 | 第131-132页 |
| 6.4 实验方法 | 第132-135页 |
| 6.4.1 土壤样品采集及前处理 | 第132页 |
| 6.4.2 土壤样品中细菌基因组DNA提取 | 第132页 |
| 6.4.3 琼脂糖凝胶电泳分析基因组DNA的纯度和完整性 | 第132页 |
| 6.4.4 Nanodrop检测基因组DNA的浓度及纯度 | 第132-133页 |
| 6.4.5 土壤细菌基因组DNA高通量测序 | 第133-134页 |
| 6.4.6 分析软件及数据库 | 第134-135页 |
| 6.5 实验结果 | 第135-166页 |
| 6.5.1 土壤样品细菌基因组DNA质量检测 | 第135-136页 |
| 6.5.2 土壤样品细菌基因组DNA物种丰度分析 | 第136-150页 |
| 6.5.3 土壤样品细菌基因组DNA耐药基因分析 | 第150-153页 |
| 6.5.4 低同源性耐药基因序列分析 | 第153-166页 |
| 6.6 讨论 | 第166-168页 |
| 6.7 本章小结 | 第168-169页 |
| 结论与展望 | 第169-173页 |
| 结论 | 第169-171页 |
| 创新之处 | 第171-172页 |
| 展望 | 第172-173页 |
| 参考文献 | 第173-186页 |
| 附录Ⅰ杆菌肽耐药基因BACA-1~BACA-9 基因及氨基酸序列 | 第186-195页 |
| 附录Ⅱ DGGE电泳回收条带基因序列 | 第195-227页 |
| 附录Ⅲ 部分Ⅰ类整合子耐药基因盒测序序列 | 第227-233页 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 | 第233-234页 |
| 致谢 | 第234-235页 |
| 附件 | 第235页 |
