论文目录 | |
| 摘要 | 第1-12页 |
| Abstract | 第12-16页 |
| 缩略语表 | 第16-17页 |
| 第一章 文献综述 | 第17-30页 |
| 1 红曲菌及其代谢产物 | 第17页 |
| 2 MPs | 第17-22页 |
| 2.1 MPs的种类 | 第18-20页 |
| 2.2 MPs的应用 | 第20页 |
| 2.3 MPs的生物学活性 | 第20-21页 |
| 2.4 MPs代谢合成途径 | 第21-22页 |
| 3 红曲菌功能基因研究情况 | 第22-23页 |
| 4 聚酮化合物和PKS | 第23-28页 |
| 4.1 聚酮化合物 | 第23页 |
| 4.2 PKS种类及作用机理 | 第23-25页 |
| 4.3 真菌次级代谢产物合成基因簇研究进展 | 第25-27页 |
| 4.3.1 真菌次级代谢产物 | 第25页 |
| 4.3.2 真菌次级代谢产物合成基因簇 | 第25-27页 |
| 4.4 真菌PKS基因克隆方法的研究 | 第27-28页 |
| 5 目的及意义 | 第28-30页 |
| 第二章 红曲菌产色素PKS基因簇的克隆及分析 | 第30-47页 |
| 1 材料 | 第30-31页 |
| 1.1 菌株与质粒 | 第30-31页 |
| 1.2 培养基 | 第31页 |
| 1.3 酶与主要试剂及配制 | 第31页 |
| 1.4 主要仪器 | 第31页 |
| 2 方法 | 第31-34页 |
| 2.1 基于KS结构域的PKS进化树的构建 | 第31-32页 |
| 2.2 PKS基因的克隆 | 第32-33页 |
| 2.3 PKS基因侧翼序列的延伸 | 第33-34页 |
| 2.4 PKS基因簇的获得 | 第34页 |
| 2.5 相关基因的生物信息学分析 | 第34页 |
| 3 结果与分析 | 第34-44页 |
| 3.1 基于KS保守结构域的PKS进化树的构建 | 第34-35页 |
| 3.2 PKS基因的克隆 | 第35-36页 |
| 3.3 完整的pksPT基因和MPs基因簇的获得 | 第36页 |
| 3.4 基因簇的生物信息学分析 | 第36-44页 |
| 3.4.1 pksPT的基因结构分析 | 第38-42页 |
| 3.4.2 fasa和fasβ基因结构分析 | 第42-43页 |
| 3.4.3 调节基因pigR基因结构分析 | 第43-44页 |
| 4 小结与讨论 | 第44-47页 |
| 4.1 小结 | 第44-45页 |
| 4.1.1 M-7中色素PKS基因的克隆 | 第44页 |
| 4.1.2 色素PKS基因簇的获得 | 第44页 |
| 4.1.3 基因的结构分析 | 第44-45页 |
| 4.2 讨论 | 第45-47页 |
| 4.2.1 关于pksPT克隆方法的讨论 | 第45页 |
| 4.2.2 关于MPs基因簇的鉴定方法的讨论 | 第45-46页 |
| 4.2.3 关于青霉属中色素合成基因簇的讨论 | 第46-47页 |
| 第三章 红曲菌M-7产色素相关基因的功能验证 | 第47-76页 |
| 1 材料 | 第47-48页 |
| 1.1 菌株与质粒 | 第47-48页 |
| 1.2 培养基 | 第48页 |
| 1.3 酶与主要试剂 | 第48页 |
| 1.4 主要仪器 | 第48页 |
| 2 方法 | 第48-56页 |
| 2.1 敲除载体的构建 | 第48-53页 |
| 2.1.1 敲除盒的构建 | 第48-52页 |
| 2.1.1.1 pksPT敲除盒的构建 | 第48-50页 |
| 2.1.1.2 fasα和fasβ敲除盒的构建 | 第50-51页 |
| 2.1.1.3 pigR敲除盒的构建 | 第51-52页 |
| 2.1.2 敲除载体的构建 | 第52-53页 |
| 2.2 农杆菌介导的红曲菌转化 | 第53-54页 |
| 2.3 转化子鉴定 | 第54页 |
| 2.3.1 转化子的PCR检测 | 第54页 |
| 2.3.2 转化子的Southern杂交检验 | 第54页 |
| 2.4 突变子性质分析 | 第54-56页 |
| 2.4.1 红曲菌孢子的收集 | 第54页 |
| 2.4.2 形态观察和显微观察 | 第54-55页 |
| 2.4.3 MPs检测 | 第55页 |
| 2.4.4 生物量和桔霉素产量测定 | 第55-56页 |
| 2.4.4.1 生物量测定 | 第55页 |
| 2.4.4.2 桔霉素产量测定 | 第55-56页 |
| 2.4.5 RT-PCR检测 | 第56页 |
| 3 结果与分析 | 第56-72页 |
| 3.1 敲除载体的构建 | 第56-60页 |
| 3.1.1 pksPT敲除载体的构建 | 第56-58页 |
| 3.1.2 fasα和fasβ敲除载休的构建 | 第58-60页 |
| 3.1.3 pigR敲除载体的构建 | 第60页 |
| 3.2 突变子的鉴定 | 第60-66页 |
| 3.2.1 △pksPT的鉴定 | 第61-63页 |
| 3.2.2 △fasα和△fasβ的鉴定 | 第63-65页 |
| 3.2.3 pigR功能缺失突变子的鉴定 | 第65-66页 |
| 3.3 突变子的性质分析 | 第66-72页 |
| 3.3.1 菌落形态和显微形态观察 | 第66-68页 |
| 3.3.2 MPs分析 | 第68-69页 |
| 3.3.3 生物量比较 | 第69-70页 |
| 3.3.4 产桔霉素能力的比较 | 第70-71页 |
| 3.3.5 RT-PCR检测 | 第71-72页 |
| 4 小结与讨论 | 第72-76页 |
| 4.1 小结 | 第72页 |
| 4.1.1 构建了敲除菌株△pksPT、△fasα、△fasβ和△pigR | 第72页 |
| 4.1.2 分析了突变子的菌落形态、显微形态和生物量的变化 | 第72页 |
| 4.1.3 评价了突变子产色素和桔霉素能力 | 第72页 |
| 4.2 讨论 | 第72-76页 |
| 4.2.1 关于突变子和出发菌株M-7生物量变化趋势的讨论 | 第72-73页 |
| 4.2.2 脂肪酸合成酶α和β两个亚基在聚酮合成途径中的功能 | 第73-74页 |
| 4.2.3 sFAS的α和β亚基作用机理 | 第74-75页 |
| 4.2.4 关于MPs和桔霉素在代谢合成途径中的关系的讨论 | 第75页 |
| 4.2.5 PKS基因簇簇内调节因子作用机理的讨论 | 第75-76页 |
| 第四章 基于trpC启动子表达体系的建立及pigR过表达菌株的构建 | 第76-90页 |
| 1 材料 | 第76-77页 |
| 1.1 菌株与质粒 | 第76-77页 |
| 1.2 酶与主要试剂 | 第77页 |
| 1.3 试剂及培养基配制 | 第77页 |
| 1.4 主要仪器 | 第77页 |
| 2 方法 | 第77-81页 |
| 2.1 trpC启动子调控的pigR表达载体的构建 | 第77-80页 |
| 2.2 农杆菌介导的红曲菌转化 | 第80页 |
| 2.3 转化子的筛选与鉴定 | 第80页 |
| 2.3.1 转化子的PCR方法检测 | 第80页 |
| 2.3.2 转化子的Southern杂交检测 | 第80页 |
| 2.4 性质分析 | 第80-81页 |
| 2.4.1 形态观察和显微观察 | 第80页 |
| 2.4.2 MPs检测 | 第80-81页 |
| 2.4.3 产桔霉素能力比较 | 第81页 |
| 2.4.4 Quantitative real-time PCR | 第81页 |
| 3 结果与分析 | 第81-88页 |
| 3.1 pigR过表达载体的构建 | 第81-82页 |
| 3.2 过表达菌株的筛选及验证 | 第82-84页 |
| 3.2.1 pigR-complemented△pigR的鉴定 | 第83-84页 |
| 3.2.2 ptrpC::pigR的鉴定 | 第84页 |
| 3.3 过表达菌株性质分析 | 第84-88页 |
| 3.3.1 菌落形态观察 | 第84-85页 |
| 3.3.2 产色素能力分析 | 第85-86页 |
| 3.3.3 桔霉素产量测定 | 第86-87页 |
| 3.3.4 表达量分析 | 第87-88页 |
| 4 小结与讨论 | 第88-90页 |
| 4.1 小结 | 第88-89页 |
| 4.1.1 构建了过表达菌株ptrpC::pigR和回复突变菌株pigR-complemented△pigR | 第88页 |
| 4.1.2 分析了ptrpC：：pigR和pigR-complemented △pigR中色素产量 | 第88页 |
| 4.1.3 分析了ptrpC:pigR和pigR-complemented△pigR桔霉素产量 | 第88页 |
| 4.1.4 分析了pigR敲除菌株和过表达菌株中pksPT、fasα、fasβ和pigR表达量 | 第88-89页 |
| 4.2 讨论 | 第89-90页 |
| 4.2.1 关于ptrpC::pigR和pigR-complemented△pigR中pigR表达量的讨论 | 第89页 |
| 4.2.2 关于ptrpC::pigR和pigR-complemented△pigR中桔霉素产量的讨论 | 第89-90页 |
| 第五章 红曲菌中MPs代谢合成途径的探讨 | 第90-102页 |
| 1 材料 | 第90-91页 |
| 1.1 菌株 | 第90-91页 |
| 1.2 主要的试剂及培养基 | 第91页 |
| 1.3 主要仪器 | 第91页 |
| 2 方法 | 第91-93页 |
| 2.1 共培养试验 | 第91页 |
| 2.2 中间产物的提取和分析 | 第91-92页 |
| 2.3 中间产物补充试验 | 第92页 |
| 2.4 ISM分析 | 第92-93页 |
| 2.4.1 菌落形态分析 | 第92页 |
| 2.4.2 色素分析 | 第92页 |
| 2.4.3 产桔霉素能力比较 | 第92页 |
| 2.4.4 生物量比较 | 第92-93页 |
| 3 结果与分析 | 第93-100页 |
| 3.1 共培养试验 | 第93页 |
| 3.2 中间产物的提取和分析 | 第93-95页 |
| 3.3 中间产物补充试验 | 第95-97页 |
| 3.4 ISM性质分析 | 第97-100页 |
| 3.4.1 菌落形态观察 | 第97页 |
| 3.4.2 色素产量测定 | 第97-98页 |
| 3.4.3 桔霉素产量测定 | 第98-99页 |
| 3.4.4 生物量测定 | 第99-100页 |
| 4 小结与讨论 | 第100-102页 |
| 4.1 小结 | 第100页 |
| 4.1.1 获得了一种MPs合成途径中的中间产物 | 第100页 |
| 4.1.2 研究了ISM的生长特性 | 第100页 |
| 4.2 讨论 | 第100-102页 |
| 4.2.1 关于MPs合成中间产物的确定 | 第100页 |
| 4.2.2 关于色素合成途径的讨论 | 第100-102页 |
| 第六章 结论与展望 | 第102-105页 |
| 1 结论 | 第102-103页 |
| 2 展望 | 第103-104页 |
| 3 创新点 | 第104-105页 |
| 参考文献 | 第105-116页 |
| 附录1 红曲菌基因组DNA的抽提 | 第116-118页 |
| 附录2 大肠杆菌感受态细胞的转化 | 第118-119页 |
| 附录3 质粒DNA的抽提 | 第119-120页 |
| 附录4 根癌农杆菌感受态细胞的制备和转化 | 第120-121页 |
| 附录5 根癌农杆菌介导的红曲菌转化 | 第121-123页 |
| 附录6 Southern杂交 | 第123-127页 |
| 附录7 RT-PCR和Realtime qPCR | 第127-130页 |
| 主要成果 | 第130-131页 |
| 致谢 | 第131页 |
