论文目录 | |
摘要 | 第1-12页 |
Abstract | 第12-15页 |
第一章 绪论 | 第15-48页 |
1.1 铂类抗肿瘤化合物研究现状和前景 | 第15-25页 |
1.1.1 铂类药物的临床发展 | 第15-17页 |
1.1.2 铂类配合物的研究进展 | 第17-24页 |
1.1.3 铂类药物的靶向运输 | 第24-25页 |
1.2 铂类化合物亚细胞水平作用机理 | 第25-34页 |
1.2.1 铂类化合物的穿膜运输和亚细胞分布 | 第25-28页 |
1.2.2 铂类化合物与DNA相互作用的无机化学原理 | 第28-29页 |
1.2.3 铂类配合物造成DNA损伤的细胞响应机制 | 第29-34页 |
1.2.3.1 染色体响应 | 第29-30页 |
1.2.3.2 DNA聚合酶 | 第30-31页 |
1.2.3.3 RNA聚合酶 | 第31页 |
1.2.3.4 常见DNA修复蛋白质 | 第31-33页 |
1.2.3.5 基因重组修复机制 | 第33页 |
1.2.3.6 其他相关蛋白质 | 第33-34页 |
1.3 铂类配合物引发的细胞耐药性机制 | 第34-36页 |
1.4 DNA结合蛋白的组学研究方法 | 第36-39页 |
1.5 HMGB家族蛋白简介 | 第39-41页 |
参考文献 | 第41-48页 |
第二章 基于Pt-DNA加合物生物探针的构筑和表征 | 第48-74页 |
2.1 概述 | 第48-49页 |
2.2 实验材料和方法 | 第49-53页 |
2.2.1 实验材料和仪器 | 第49页 |
2.2.2 制备顺铂/奥沙利铂1,2-GG链内交联DNA加合物 | 第49-50页 |
2.2.2.1 顺铂的活化 | 第49-50页 |
2.2.2.2 奥沙利铂中间体的合成 | 第50页 |
2.2.2.3 顺铂/奥沙利铂DNA加合物的制备 | 第50页 |
2.2.3 制备三核铂的1,3-GpNpG和1,4-GpNpNpG链内交联加合物 | 第50页 |
2.2.4 反相高效液相色谱纯化Pt-DNA加合物 | 第50-51页 |
2.2.5 短链DNA和多聚组氨酸的交联反应 | 第51页 |
2.2.6 Ni~(2+)亲和色谱纯化多聚组氨酸标记的寡聚核苷酸 | 第51-52页 |
2.2.7 互补单链DNA退火制备双链生物探针 | 第52页 |
2.2.8 液相色谱表征双链探针 | 第52页 |
2.2.9 聚丙烯酰胺凝胶电泳表征探针 | 第52页 |
2.2.10 MALDI-TOF表征探针分子量 | 第52-53页 |
2.2.11 荧光染色连续变温法测定DNA探针熔解温度 | 第53页 |
2.3 结果与讨论 | 第53-72页 |
2.3.1 专一位点Pt-DNA加合物的制备和表征 | 第53-63页 |
2.3.1.1 顺铂1,2-GpG链内交联(P1) | 第56-57页 |
2.3.1.2 奥沙利铂(1R,2R-DACH,P2)及其对映体(1S,2S-DACH,P3)1,2-GpG链内交联 | 第57-59页 |
2.3.1.3 邻苯二胺铂1,2-GpG链内交联(P4) | 第59页 |
2.3.1.4 三核铂与DNA加合物的制备和表征 | 第59-63页 |
2.3.2 末端氨基修饰DNA和多肽的交联反应 | 第63-65页 |
2.3.3 双链杂交POC(peptide oligonucleotides conjugate)探针的表征 | 第65-67页 |
2.3.4 DNA-Peptide杂交双链探针的熔解温度测定 | 第67-72页 |
2.3.4.1 顺铂及奥沙利铂1,2-GpG交联对于探针稳定性的影响 | 第68页 |
2.3.4.2 三核铂不同交联方式对探针稳定性的影响 | 第68-72页 |
2.4 结论 | 第72页 |
参考文献 | 第72-74页 |
第三章 顺铂-DNA加合物的细胞内识别蛋白质及其翻译后修饰研究 | 第74-158页 |
3.1 概述 | 第74-76页 |
3.2 试验材料与方法 | 第76-86页 |
3.2.1 材料与仪器 | 第76页 |
3.2.2 细胞培养 | 第76-77页 |
3.2.3 细胞总蛋白提取 | 第77页 |
3.2.3.1 非变性方法提取细胞总蛋白 | 第77页 |
3.2.3.2 SDS变性法提取细胞总蛋白 | 第77页 |
3.2.4 Pull Down实验 | 第77-78页 |
3.2.5 SDS蛋白质凝胶电泳 | 第78页 |
3.2.6 双向电泳 | 第78-79页 |
3.2.6.1 样品制备 | 第78页 |
3.2.6.2 第一向等电聚焦(IEF) | 第78-79页 |
3.2.6.3 第二向SDS蛋白电泳(SDS-PAGE) | 第79页 |
3.2.7 银染 | 第79页 |
3.2.8 蛋白质多肽指纹谱(PMF)鉴定 | 第79-81页 |
3.2.8.1 差异蛋白点的指认和切胶 | 第79-80页 |
3.2.8.2 蛋白质胶内酶解和多肽抽提 | 第80-81页 |
3.2.8.3 MALDI-TOF肽指纹图谱采集 | 第81页 |
3.2.9 免疫印迹(Western Blot) | 第81页 |
3.2.10 免疫沉淀 | 第81-82页 |
3.2.11 实时荧光定量PCR | 第82-84页 |
3.2.11.1 改良的Trizol法提取细胞总RNA | 第82页 |
3.2.11.2 RNA逆转录制备cDNA文库 | 第82-83页 |
3.2.11.3 实时荧光相对定量 | 第83-84页 |
3.2.12 碱式磷酸酶去蛋白磷酸化 | 第84页 |
3.2.13 二氧化钛法富集磷酸化多肽 | 第84页 |
3.2.14 液质联用(LC-MSMS)鉴定蛋白质翻译后位点 | 第84-85页 |
3.2.15 激光共聚焦免疫荧光成像 | 第85页 |
3.2.16 细胞内间接免疫荧光的流式细胞术分析 | 第85-86页 |
3.3 结果与讨论 | 第86-107页 |
3.3.1 顺铂-DNA1,2-GG链内交联加合物的细胞内识别蛋白质 | 第86-90页 |
3.3.2 识别顺铂损伤DNA的HMGB1/2细胞内翻译后修饰研究 | 第90-98页 |
3.3.2.1 翻译后修饰蛋白水平研究 | 第90-93页 |
3.3.2.2 MALDI-TOF鉴定蛋白质翻译后修饰位点方法初探 | 第93-95页 |
3.3.2.3 液质联用(LC-MSMS)鉴定蛋白质翻译后修饰位点 | 第95-98页 |
3.3.3 顺铂刺激下细胞内HMGB蛋白质表达水平初探 | 第98-99页 |
3.3.4 顺铂刺激下细胞内其他蛋白mRNA转录水平初探 | 第99-101页 |
3.3.5 顺铂刺激下细胞内hnRNP DO蛋白表达研究 | 第101-104页 |
3.3.6 激光共聚焦免疫荧光成像研究蛋白质细胞内分布 | 第104-107页 |
3.4 结语 | 第107-108页 |
参考文献 | 第108-111页 |
附录1 | 第111-115页 |
附录2 | 第115-120页 |
附录3 | 第120-158页 |
附表1 HMGB1蛋白亚型A的翻译后修饰质谱鉴定肽段信息 | 第120-127页 |
附表2 HMGB1蛋白亚型B的翻译后修饰质谱鉴定肽段信息 | 第127-139页 |
附表3 HMGB1蛋白亚型C的翻译后修饰质谱鉴定肽段信息 | 第139-147页 |
附表4 HMGB1蛋白亚型D的翻译后修饰质谱鉴定肽段信息 | 第147-158页 |
第四章 非离去基团对Pt-DNA加合物与细胞内蛋白质相互作用影响 | 第158-180页 |
4.1 概述 | 第158-161页 |
4.2 试验材料与方法 | 第161-164页 |
4.2.1 材料与仪器 | 第161-162页 |
4.2.2 细胞培养 | 第162页 |
4.2.3 细胞总蛋白抽提 | 第162页 |
4.2.3.1 非变性细胞总蛋白提取 | 第162页 |
4.2.3.2 SDS变性法抽提细胞总蛋白 | 第162页 |
4.2.4 Pull Down实验 | 第162页 |
4.2.5 双向电泳 | 第162-163页 |
4.2.5.1 样品制备 | 第162-163页 |
4.2.5.2 第一向等电聚焦(IEF) | 第163页 |
4.2.5.3 第二向SDS蛋白电泳(SDS-PAGE) | 第163页 |
4.2.6 多肽指纹谱鉴定蛋白质 | 第163页 |
4.2.6.1 差异蛋白点的指认和切胶 | 第163页 |
4.2.6.2 蛋白质胶内酶解和多肽抽提 | 第163页 |
4.2.6.3 MALDI-TOF肽指纹图谱采集 | 第163页 |
4.2.7 免疫印迹(Western Blot) | 第163页 |
4.2.8 激光共聚焦免疫荧光成像 | 第163-164页 |
4.3 结果与讨论 | 第164-176页 |
4.3.1 奥沙利铂及其类似物的Pt-DNA加合物细胞内识别蛋白初探 | 第164-169页 |
4.3.2 非离去基团对HMGB1/2识别DNA-Pt加合物的影响 | 第169-173页 |
4.3.3 激光共聚焦成像研究奥沙利铂刺激下细胞内HMGB1蛋白定位 | 第173-174页 |
4.3.4 铂化合物刺激下细胞内HMGB1相关通路关键蛋白的表达量变化 | 第174-176页 |
4.4 结论 | 第176-177页 |
参考文献 | 第177-180页 |
第五章 新型三核铂配合物的Pt-DNA加合物与细胞内蛋白质相互作用研究 | 第180-209页 |
5.1 概述 | 第180-182页 |
5.2 试验材料与方法 | 第182-185页 |
5.2.1 材料与仪器 | 第182页 |
5.2.2 细胞培养 | 第182-183页 |
5.2.3 非变性细胞总蛋白提取 | 第183页 |
5.2.4 Pull Down实验 | 第183页 |
5.2.5 SDS蛋白质凝胶电泳 | 第183页 |
5.2.6 双向电泳 | 第183页 |
5.2.6.1 样品制备 | 第183页 |
5.2.6.2 第一向等电聚焦(IEF) | 第183页 |
5.2.6.3 第二向SDS蛋白电泳(SDS-PAGE) | 第183页 |
5.2.7 多肽指纹谱鉴定蛋白质 | 第183-184页 |
5.2.7.1 差异蛋白点的指认和切胶 | 第183页 |
5.2.7.2 蛋白质胶内酶解和多肽抽提 | 第183-184页 |
5.2.7.3 MALDI-TOF肽指纹图谱采集 | 第184页 |
5.2.8 激光共聚焦免疫荧光成像 | 第184页 |
5.2.9 实时荧光定量PCR | 第184页 |
5.2.9.1 改良的Trizol法提取细胞总RNA | 第184页 |
5.2.9.2 RNA逆转录制备cDNA | 第184页 |
5.2.10 流式细胞术分析细胞周期和凋亡 | 第184-185页 |
5.2.11 流式细胞仪检测细胞活性氧物种(ROS)水平 | 第185页 |
5.3 结果与讨论 | 第185-204页 |
5.3.1 [Pt_3(HPTAB)Cl_3](ClO_4)_3的1,3-链内交联加合物识别蛋白初探 | 第185-189页 |
5.3.2 [Pt_3(HPTAB)Cl_3](ClO_4)_3的DNA链间交联加合物识别蛋白初探 | 第189-191页 |
5.3.3 MTPC的1,3-链内交联加合物细胞内识别蛋白初探 | 第191-194页 |
5.3.4 免疫荧光研究[Pt_3(HTAB)Cl_3](ClO_4)_3诱发的细胞死亡方式 | 第194-196页 |
5.3.5 流式细胞术研究[Pt_3(HPTAB)Cl_3](ClO_4)_3对细胞周期的影响 | 第196-198页 |
5.3.6 [Pt_3(HPTAB)Cl_3](ClO_4)_3对A549与A549/cisR细胞的活性差异研究 | 第198-199页 |
5.3.7 [Pt_3(HPTAB)Cl_3](ClO_4)_3刺激下细胞内相关基因转录水平研究 | 第199-203页 |
5.3.9 铂类配合物刺激下细胞内活性氧(ROS)物种水平变化和比较 | 第203-204页 |
5.4 结论 | 第204-205页 |
参考文献 | 第205-209页 |
致谢 | 第209-211页 |