论文目录 | |
| 中文摘要 | 第1-11页 |
| ABSTRACT | 第11-14页 |
| 第一章 人工改造血红蛋白及血液代用品的研究进展 | 第14-38页 |
| 1.1 前言 | 第14-16页 |
| 1.2 血红蛋白的生理功能 | 第16-20页 |
| 1.2.1 血红蛋白的携氧功能 | 第16-19页 |
| 1.2.2 波尔效应 | 第19-20页 |
| 1.3 以血红蛋白为基础的血液代用品 | 第20-30页 |
| 1.3.1 直接以血红蛋白为血液代用品 | 第20-21页 |
| 1.3.2 以人工改造血红蛋白为血液代用品的研究 | 第21-30页 |
| 1.3.2.1 人工改造调整血红蛋白的氧亲和性 | 第21-22页 |
| 1.3.2.2 人工改造抗血红蛋白解聚 | 第22-24页 |
| 1.3.2.3 人工改造提高血红蛋白的分子大小 | 第24-30页 |
| 1.4 血红蛋白携氧能力的评价 | 第30-31页 |
| 1.4.1 氧亲和力 | 第30-31页 |
| 1.4.2 亚基间协同性 | 第31页 |
| 1.4.3 血红素铁的价态 | 第31页 |
| 1.5 血红蛋白类血液代用品的安全性评价 | 第31-34页 |
| 1.5.1 对凝血性能的影响分析 | 第32页 |
| 1.5.2 对免疫系统的影响分析 | 第32-33页 |
| 1.5.3 对肾功能的影响评价 | 第33页 |
| 1.5.4 对血液动力学的影响分析 | 第33-34页 |
| 1.6 血液代用品研究中存在的问题 | 第34-36页 |
| 1.7 本课题的研究目的和目标 | 第36-38页 |
| 第二章 无基质猪血红蛋白的制备及其性能 | 第38-48页 |
| 2.1 引言 | 第38-39页 |
| 2.2 材料和方法 | 第39-43页 |
| 2.2.1 材料 | 第39页 |
| 2.2.1.1 主要仪器 | 第39页 |
| 2.2.1.2 主要试剂 | 第39页 |
| 2.2.2 主要方法 | 第39-43页 |
| 2.2.2.1 无基质猪血红蛋白的提取和纯化 | 第39-40页 |
| 2.2.2.2 氧解离曲线、半饱和氧分压、希尔系数的测定 | 第40页 |
| 2.2.2.3 猪血红蛋白浓度的测定 | 第40页 |
| 2.2.2.4 高铁血红蛋白含量的测定 | 第40-41页 |
| 2.2.2.5 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 | 第41-42页 |
| 2.2.2.6 pH等电聚焦电泳分析 | 第42-43页 |
| 2.2.2.7 猪血红蛋白的保存稳定性实验 | 第43页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第43-48页 |
| 2.3.1 无基质猪血红蛋白的理化性质和氧结合特性 | 第43-44页 |
| 2.3.2 无基质猪血红蛋白的电泳分析 | 第44-45页 |
| 2.3.3 IHP对猪血红蛋白的别构调节效应分析 | 第45页 |
| 2.3.4 冻融及保护剂对猪血红蛋白储存稳定性的影响 | 第45-48页 |
| 第三章 小分子化合物修饰猪血红蛋白的条件及其性能 | 第48-60页 |
| 3.1 引言 | 第48-50页 |
| 3.2 材料和方法 | 第50-52页 |
| 3.2.1 材料 | 第50页 |
| 3.2.1.1 试剂 | 第50页 |
| 3.2.2 方法 | 第50-52页 |
| 3.2.2.1 猪血红蛋白的理化性能分析(见第二章) | 第50页 |
| 3.2.2.2 氧化开环棉子糖的制备 | 第50页 |
| 3.2.2.3 氧化棉子糖产率的测定 | 第50页 |
| 3.2.2.4 氧化棉子糖对猪血红蛋白修饰反应条件 | 第50-51页 |
| 3.2.2.5 DBBF对猪血红蛋白修饰反应条件 | 第51页 |
| 3.2.2.6 DBBF修饰猪血红蛋白的条件优化 | 第51-52页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第52-60页 |
| 3.3.1 氧化开环棉子糖产率分析 | 第52页 |
| 3.3.2 氧化棉子糖修饰猪血红蛋白性能分析 | 第52-54页 |
| 3.3.2.1 氧化棉子糖修饰猪血红蛋白等电点分析 | 第52-53页 |
| 3.3.2.2 氧化棉子糖修饰猪血红蛋白的SDS-PAGE分析 | 第53页 |
| 3.3.2.3 氧化棉子糖修饰猪血红蛋白的携氧性能分析 | 第53-54页 |
| 3.3.3 DBBF修饰猪血红蛋白条件及其性能分析 | 第54-60页 |
| 3.3.3.1 脱氧与氧合状态对DBBF修饰猪血红蛋白性能的影响 | 第54-55页 |
| 3.3.3.2 反应时间对DBBF修饰猪血红蛋白的影响 | 第55-56页 |
| 3.3.3.3 DBBF浓度对DBBF修饰猪血红蛋白的影响 | 第56页 |
| 3.3.3.4 别构效应调节剂对DBBF修饰猪血红蛋白的影响 | 第56-60页 |
| 第四章 聚乙二醇大分子化猪血红蛋白 | 第60-74页 |
| 4.1 引言 | 第60-63页 |
| 4.2 材料与方法 | 第63-65页 |
| 4.2.1 材料 | 第63页 |
| 4.2.2 方法 | 第63-65页 |
| 4.2.2.1 mPEG的活化方法 | 第63-64页 |
| 4.2.2.2 mPEG修饰猪血红蛋白的反应条件 | 第64-65页 |
| 4.2.2.3 mPEG修饰DBBF内交联猪血红蛋白 | 第65页 |
| 4.2.2.4 mPEG修饰猪血红蛋白的反应条件优化 | 第65页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第65-74页 |
| 4.3.1 mPEG活化程度分析 | 第65页 |
| 4.3.2 mPEG修饰猪血红蛋白 | 第65-67页 |
| 4.3.3 mPEG修饰DBBF内交联猪血红蛋白 | 第67-69页 |
| 4.3.4 mPEG修饰DBBF内交联猪血红蛋白的条件优化 | 第69-74页 |
| 4.3.4.1 反应时间的影响 | 第69-70页 |
| 4.3.4.2 反应pH的影响 | 第70页 |
| 4.3.4.3 反应温度的影响 | 第70-71页 |
| 4.3.4.4 PEG与血红蛋白浓度比的影响 | 第71-74页 |
| 第五章 人工改造猪血红蛋白的生物安全性分析 | 第74-80页 |
| 5.1 引言 | 第74页 |
| 5.2 材料与方法 | 第74-76页 |
| 5.2.1 主要仪器 | 第74页 |
| 5.2.2 主要试剂 | 第74页 |
| 5.2.3 抗血清的制备 | 第74-75页 |
| 5.2.4 酶联免疫吸附实验 | 第75-76页 |
| 5.2.5 静脉注射血红蛋白修饰产物的动物试验 | 第76页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第76-80页 |
| 5.3.1 血红蛋白免疫家兔的抗体水平分析 | 第76-77页 |
| 5.3.2 静脉注射猪血红蛋白修饰产物对家兔脏器生化指标的影响 | 第77-80页 |
| 第六章 松弛素家族肽及其受体的研究进展 | 第80-106页 |
| 6.1 引言 | 第80页 |
| 6.2 松弛素及松弛素家族肽 | 第80-83页 |
| 6.3 松弛素的结构 | 第83-85页 |
| 6.4 松驰素的生物学功能 | 第85-88页 |
| 6.4.1 松驰素的生殖系统效应 | 第86-87页 |
| 6.4.2 松弛素是心血管系统相关激素 | 第87-88页 |
| 6.5 松弛素家族肽受体及其研究进展 | 第88-103页 |
| 6.5.1 G蛋白偶联受体 | 第88-89页 |
| 6.5.2 RLX和胰岛素等激素的作用机制 | 第89-91页 |
| 6.5.3 富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体 | 第91-92页 |
| 6.5.4 松弛素家族肽受体 | 第92-103页 |
| 6.5.4.1 RXFP1和RXFP2的特性 | 第92-94页 |
| 6.5.4.2 小肽样RXFP(RXFP3和RXFP4)的特征 | 第94-95页 |
| 6.5.4.3 受体的进化 | 第95页 |
| 6.5.4.4 受体保守性 | 第95-96页 |
| 6.5.4.5 RXFPs的遗传功能 | 第96-98页 |
| 6.5.4.6 受体分布 | 第98-99页 |
| 6.5.4.7 RXFP1和RXFP2的剪接变异体 | 第99页 |
| 6.5.4.8 受体的结构 | 第99-100页 |
| 6.5.4.9 RXFP1和RXFP2受体的结合特性 | 第100-101页 |
| 6.5.4.10 RXFP3和RXFP4受体的结合特性 | 第101页 |
| 6.5.4.11 RXFP受体激活的信号转导机制 | 第101-103页 |
| 6.6 松弛素及其受体研究的意义及本课题的目标 | 第103-106页 |
| 第七章 BP蛋白表达系统的构建 | 第106-126页 |
| 7.1 引言 | 第106-108页 |
| 7.2 材料和方法 | 第108-120页 |
| 7.2.1 主要仪器 | 第108-109页 |
| 7.2.2 主要试剂 | 第109-110页 |
| 7.2.3 实验方法 | 第110-120页 |
| 7.2.3.1 7BP和8BP蛋白重组质粒的构建 | 第110-113页 |
| 7.2.3.2 分光光度法分析DNA浓度和纯度 | 第113页 |
| 7.2.3.3 1%或1.5%琼脂糖凝胶电泳 | 第113页 |
| 7.2.3.4 酚法提取DNA | 第113-114页 |
| 7.2.3.5 DNA胶回收法 | 第114页 |
| 7.2.3.6 DNA末端脱磷反应 | 第114页 |
| 7.2.3.7 连接反应 | 第114页 |
| 7.2.3.8 酒精沉淀提纯DNA | 第114页 |
| 7.2.3.9 感受态细胞的制备 | 第114-115页 |
| 7.2.3.10 电转化感受态细胞 | 第115页 |
| 7.2.3.11 菌种保存 | 第115页 |
| 7.2.3.12 小量制备DNA | 第115-116页 |
| 7.2.3.13 大量制备重组质粒 | 第116页 |
| 7.2.3.14 DNA序列分析 | 第116页 |
| 7.2.3.15 HEK293T细胞的培养 | 第116页 |
| 7.2.3.16 细胞活化 | 第116-117页 |
| 7.2.3.17 传代培养 | 第117页 |
| 7.2.3.18 液氮保存细胞 | 第117页 |
| 7.2.3.19 多聚赖氨酸包被 | 第117页 |
| 7.2.3.20 非稳态转染细胞的制备 | 第117-118页 |
| 7.2.3.21 液体闪烁计数器计数 | 第118页 |
| 7.2.3.22 表面受体与配体的结合试验 | 第118-119页 |
| 7.2.3.23 24孔细胞培养板结合试验 | 第119页 |
| 7.2.3.24 6孔细胞培养板的结合试验 | 第119-120页 |
| 7.3 结果与讨论 | 第120-126页 |
| 第八章 BP蛋白的分离纯化及其性能 | 第126-140页 |
| 8.1 引言 | 第126页 |
| 8.2 材料和方法 | 第126-133页 |
| 8.2.1 主要仪器 | 第126-127页 |
| 8.2.2 主要试剂 | 第127页 |
| 8.2.3 实验方法 | 第127-133页 |
| 8.2.3.1 HEK293T细胞的活化、传代培养及保存 | 第127页 |
| 8.2.3.2 稳态转染细胞的制备 | 第127-128页 |
| 8.2.3.3 稳态细胞表达BP蛋白 | 第128页 |
| 8.2.3.4 BP蛋白的分离纯化 | 第128-129页 |
| 8.2.3.5 配体-受体交联试验(cross-linking test) | 第129-130页 |
| 8.2.3.6 细胞培养板上的交联试验 | 第130页 |
| 8.2.3.7 BP与RLX的进一步交联试验(Further Cross linking) | 第130页 |
| 8.2.3.8 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第130页 |
| 8.2.3.9 用干胶机制备凝胶电泳的干胶片 | 第130页 |
| 8.2.3.10 免疫蛋白印迹分析 | 第130-132页 |
| 8.2.3.11 蛋白质含量测定 | 第132页 |
| 8.2.3.12 固相合成短肽Flag | 第132-133页 |
| 8.2.3.13 胞内cAMP的检测 | 第133页 |
| 8.3 结果与讨论 | 第133-140页 |
| 8.3.1 稳态转染细胞结合特征 | 第133-134页 |
| 8.3.2 7BP蛋白的纯化和交联试验 | 第134-135页 |
| 3.3.3 FLAG肽的合成 | 第135-137页 |
| 8.3.4 BP蛋白对RLX细胞效应的阻断实验 | 第137-140页 |
| 第九章 BP蛋白芯片的构建及其性能分析 | 第140-144页 |
| 9.1 引言 | 第140-141页 |
| 9.2 材料与方法 | 第141-142页 |
| 9.1.1 主要仪器和试剂 | 第141页 |
| 9.1.2 基本方法 | 第141-142页 |
| 9.1.2.1 芯片预处理和上样 | 第141页 |
| 9.1.2.2 芯片检测、数据采集和参数设置 | 第141页 |
| 9.1.2.3 SELDI-MS分析7BP | 第141-142页 |
| 9.1.2.4 固定化7BP蛋白芯片捕获相应配体的试验 | 第142页 |
| 9.3 结果与讨论 | 第142-144页 |
| 9.3.1 BP蛋白在芯片上的固定化 | 第142-143页 |
| 9.3.2 固定化7BP的蛋白芯片对配体-松弛素的捕获性能 | 第143-144页 |
| 参考文献 | 第144-156页 |
| 致谢 | 第156页 |
