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假单胞菌降解尼古丁的分子机制研究

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假单胞菌降解尼古丁的分子机制研究
论文目录
 
目录第1-10页
摘要第10-13页
ABSTRACT第13-17页
1 绪论第17-35页
  1.1 尼古丁及其理化性质第17页
  1.2 尼古丁对环境的污染及生物毒性第17-19页
    1.2.1 不同来源的尼古丁对环境的污染第17-18页
    1.2.2 尼古丁的生物毒性第18-19页
  1.3 微生物降解尼古丁的机制研究进展第19-30页
    1.3.1 降解尼古丁的微生物种类第19-21页
    1.3.2 尼古丁的微生物代谢途径及分子机制第21-30页
  1.4 微生物降解尼古丁的应用研究第30-32页
  1.5 本研究的目的、意义和主要内容第32-35页
    1.5.1 研究的目的和意义第32-33页
    1.5.2 研究的主要内容第33-35页
2 尼古丁降解菌Pseudomonas sp.HZN6的分离、鉴定、降解特性及降解途径的研究第35-49页
  2.1 引言第35页
  2.2 材料与方法第35-40页
    2.2.1 菌株、试剂与培养基第35-36页
    2.2.2 降解菌株的富集与分离第36页
    2.2.3 降解菌株的培养特征及生理生化鉴定第36页
    2.2.4 菌体基因组DNA的提取第36-37页
    2.2.5 菌株16S rRNA基因的PCR扩增第37页
    2.2.6 16S rRNA基因PCR产物的T/A克隆第37页
    2.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备与酶连产物的转化第37-38页
    2.2.8 质粒DNA的小量提取第38页
    2.2.9 16S rRNA基因序列测定和系统发育地位的确定第38-39页
    2.2.10 菌体生长量的测定及降解种子液的制备第39页
    2.2.11 尼古丁及中间产物检测方法第39-40页
  2.3 结果与讨论第40-48页
    2.3.1 尼古丁降解菌株的分离与筛选第40页
    2.3.2 降解菌株的菌落形态及生理生化特征第40-41页
    2.3.3 降解菌株的系统发育地位研究第41-42页
    2.3.4 环境条件对菌株HZN6降解尼古丁的影响第42-45页
    2.3.5 尼古丁的代谢产物鉴定和代谢途径分析第45-48页
  2.4 小结第48-49页
3 转座子随机突变文库构建与筛选第49-59页
  3.1 引言第49页
  3.2 材料与方法第49-53页
    3.2.1 菌株和质粒第49页
    3.2.2 试剂与培养基第49-50页
    3.2.3 菌株的培养条件第50页
    3.2.4 转座子诱变第50-51页
    3.2.5 尼古丁降解失活突变株的筛选第51-52页
    3.2.6 尼古丁降解失活突变株的验证第52-53页
    3.2.7 尼古丁及其中间产物的检测方法第53页
  3.3 结果与讨论第53-58页
    3.3.1 转座子诱变最优条件的选择第53页
    3.3.2 转座突变的效率第53-54页
    3.3.3 几株代表性突变株的表型分析第54-58页
  3.4 小结第58-59页
4 3-琥珀酰吡啶降解相关基因sirA2的克隆和功能鉴定第59-85页
  4.1 引言第59页
  4.2 材料与方法第59-72页
    4.2.1 试剂与培养基第59-60页
    4.2.2 菌株、质粒与培养条件第60页
    4.2.3 分子生物学操作方法第60-61页
    4.2.4 转座子插入突变基因的SEFA-PCR克隆第61-63页
    4.2.5 克隆序列的测定、组装与分析第63-64页
    4.2.6 sirA2基因的敲除第64-69页
    4.2.7 sirA2基因的功能互补第69-71页
    4.2.8 重组菌株降解尼古丁、SP和次黄嘌呤的特性分析第71页
    4.2.9 尼古丁、SP和次黄嘌呤的检测方法第71-72页
  4.3 结果与分析第72-80页
    4.3.1 突变株N6ml的筛选与表型分析第72-73页
    4.3.2 SEFA-PCR克隆突变基因第73页
    4.3.3 克隆基因的测序、组装与分析第73-77页
    4.3.4 sirA2基因的敲除与功能互补第77-79页
    4.3.5 钨对SP和次黄嘌呤降解的影响第79-80页
  4.4 讨论第80-82页
    4.4.1 sirA基因的来源与功能第81页
    4.4.2 硫转移酶与羟化酶的相互关系第81-82页
  4.5 小结第82-85页
5 假氧尼古丁氧化酶和3-琥珀酰半醛吡啶脱氢酶的克隆、表达和酶学特性研究第85-121页
  5.1 引言第85页
  5.2 材料与方法第85-101页
    5.2.1 试剂与培养基第85-86页
    5.2.2 菌株、质粒与培养条件第86-87页
    5.2.3 分子生物学操作方法第87页
    5.2.4 突变株N6mC8突变基因的SEFA-PCR克隆第87页
    5.2.5 克隆序列的测定、组装与分析第87-88页
    5.2.6 假氧尼古丁氧化酶和3-琥珀酰半醛吡啶脱氢酶的异源表达和纯化第88-92页
    5.2.7 尼古丁及代谢产物的检测方法第92-93页
    5.2.8 酶的功能鉴定、动力学参数测定及酶学特性分析第93-95页
    5.2.9 pao和sap基因的敲除第95-99页
    5.2.10 pao基因的功能互补第99-101页
    5.2.11 重组菌株降解特性分析第101页
  5.3 结果与分析第101-118页
    5.3.1 突变株N6mC8的筛选与表型分析第101-102页
    5.3.2 SEFA-PCR克隆突变基因第102-103页
    5.3.3 克隆基因的测序、组装与分析第103-105页
    5.3.4 PNAO和SAPD的基因克隆、异源表达与纯化第105-106页
    5.3.5 PNAO的辅酶FAD第106-108页
    5.3.6 PNAO的功能鉴定第108-111页
    5.3.7 PNAO的酶学特性与动力学参数第111-114页
    5.3.8 SAPD的功能鉴定第114-116页
    5.3.9 pao和sap基因的敲除与功能互补第116-117页
    5.3.10 重组菌株的降解特性分析第117-118页
  5.4 讨论第118-120页
    5.4.1 pao和sap基因为新基因第119页
    5.4.2 PNAO酶的特性第119-120页
  5.5 小结第120-121页
6 尼古丁氧化酶基因的克隆和功能鉴定第121-155页
  6.1 引言第121页
  6.2 材料与方法第121-137页
    6.2.1 试剂与培养基第121-122页
    6.2.2 菌株、质粒与培养条件第122-123页
    6.2.3 常规分子生物学操作方法第123页
    6.2.4 pao基因上游基因序列的SEFA-PCR克隆第123页
    6.2.5 克隆序列的测定、组装与分析第123-124页
    6.2.6 尼古丁氧化酶NOX的基因克隆、异源表达与纯化第124-125页
    6.2.7 nox基因的敲除第125-129页
    6.2.8 nox基因的功能互补第129-131页
    6.2.9 RNA的提取与RT-PCR第131-132页
    6.2.10 NOX蛋白三维结构的预测与分子对接第132-133页
    6.2.11 NOX蛋白的定点突变第133-136页
    6.2.12 重组菌株降解特性分析第136页
    6.2.13 尼古丁及中间产物的分析方法第136-137页
  6.3 结果与分析第137-151页
    6.3.1 SEFA-PCR克隆pao基因上游未知序列第137-138页
    6.3.2 克隆基因的测序、组装与分析第138-140页
    6.3.3 nox基因的体外功能鉴定第140-142页
    6.3.4 nox基因的转录第142-143页
    6.3.5 nox基因的体内敲除与功能互补第143-145页
    6.3.6 重组菌株的降解特性第145-146页
    6.3.7 NOX的无手性选择性降解尼古丁第146-147页
    6.3.8 NOX的异源表达与纯化第147-149页
    6.3.9 NOX的同源模建与分子对接第149-151页
    6.3.10 NOX的定点突变第151页
  6.4 讨论第151-154页
  6.5 小结第154-155页
7 论文总结第155-159页
  7.1 研究结论第155-156页
  7.2 创新点第156页
  7.3 不足与展望第156-159页
参考文献第159-177页
攻读博士学位期间研究成果与个人荣誉第177-179页
研究成果第177-178页
个人荣誉第178-179页
致谢第179-180页

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