论文目录 | |
| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 第一章 前言 | 第10-18页 |
| 1.1 猪流行性腹泻 | 第10-13页 |
| 1.1.1 猪流行性腹泻概述 | 第10页 |
| 1.1.2 猪流行性腹泻病毒基因结构 | 第10-11页 |
| 1.1.3 PEDVS蛋白及功能 | 第11-12页 |
| 1.1.4 猪流行性腹泻疫苗的研究进展 | 第12-13页 |
| 1.2 杆状病毒及其在疫苗生产中的应用 | 第13-17页 |
| 1.2.1 杆状病毒概述 | 第13-14页 |
| 1.2.2 杆状病毒多基因表达载体系统 | 第14-17页 |
| 1.2.3 杆状病毒表达系统在疫苗生产中的应用 | 第17页 |
| 1.3 研究目的、内容及意义 | 第17-18页 |
| 第二章 实验材料和方法 | 第18-38页 |
| 2.1 实验材料 | 第18-19页 |
| 2.1.1 载体及宿主菌 | 第18页 |
| 2.1.2 酶和试剂 | 第18页 |
| 2.1.3 生物材料 | 第18-19页 |
| 2.2 主要仪器 | 第19页 |
| 2.3 实验室常用溶液和试剂配制 | 第19-23页 |
| 2.3.1 琼脂糖凝胶电泳试剂 | 第19页 |
| 2.3.2 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂 | 第19-20页 |
| 2.3.3 蛋白免疫印迹所需试剂 | 第20页 |
| 2.3.4 蛋白纯化所需试剂 | 第20-21页 |
| 2.3.5 ELISA检测抗体特异性所需试剂 | 第21页 |
| 2.3.6 抗生素的配制及实验相关试剂的配制 | 第21-22页 |
| 2.3.7 大肠杆菌培养基的配制 | 第22页 |
| 2.3.8 昆虫细胞Grace培养基的配制 | 第22-23页 |
| 2.4 常用分子生物学实验方法 | 第23-24页 |
| 2.4.1 质粒的提取 | 第23页 |
| 2.4.2 琼脂糖凝胶电泳 | 第23页 |
| 2.4.3 琼脂糖凝胶回收 | 第23页 |
| 2.4.4 PCR产物回收 | 第23页 |
| 2.4.5 大肠杆菌感受态细胞的制备方法 | 第23-24页 |
| 2.4.6 感受态细胞AcMultiBacmid/SW106/asd-/inv+的制备 | 第24页 |
| 2.4.7 菌种的保存 | 第24页 |
| 2.5 昆虫细胞培养基本操作 | 第24-26页 |
| 2.5.1 细胞的复苏 | 第24-25页 |
| 2.5.2 细胞的传代 | 第25页 |
| 2.5.3 细胞的冻存 | 第25页 |
| 2.5.4 细胞计数 | 第25-26页 |
| 2.6 多种转移载体的构建 | 第26-30页 |
| 2.6.1 PEDVS1的克隆与测序 | 第27-29页 |
| 2.6.2 p10启动子驱动的转移载体的构建 | 第29页 |
| 2.6.3 ph启动子驱动的转移载体的构建 | 第29-30页 |
| 2.6.4 构建p10和ph杂合的载体 | 第30页 |
| 2.7 重组病毒的获得 | 第30-32页 |
| 2.7.1 转座和重组 | 第30页 |
| 2.7.2 重组细菌病毒菌液感染昆虫细胞 | 第30-31页 |
| 2.7.3 病毒的扩大培养 | 第31页 |
| 2.7.4 病毒滴度的测定 | 第31-32页 |
| 2.8 蛋白表达的检测 | 第32-33页 |
| 2.8.1 样品处理 | 第32页 |
| 2.8.2 SDS-PAGE电泳 | 第32-33页 |
| 2.8.3 WesternBlot检测蛋白表达 | 第33页 |
| 2.9 表达蛋白的纯化 | 第33-34页 |
| 2.10 蛋白浓度的测定 | 第34-35页 |
| 2.11 抗原的制备 | 第35页 |
| 2.12 动物小量安全实验 | 第35-36页 |
| 2.13 免疫鼠血清的抗体特异性检测 | 第36-38页 |
| 2.13.1 原核表达pET28a-PEDVS1蛋白 | 第36-37页 |
| 2.13.2 ELISA检测血清抗体特异性 | 第37-38页 |
| 第三章 结果和分析 | 第38-57页 |
| 3.1 PEDVS1的克隆表达及测序 | 第38-39页 |
| 3.1.1 PEDVS1基因克隆 | 第38页 |
| 3.1.2 pMD19T-PEDVS1载体的构建及测序 | 第38-39页 |
| 3.2 多种转移载体的构建 | 第39-45页 |
| 3.2.1 p10驱动的载体的构建 | 第39-41页 |
| 3.2.2 ph驱动的载体的构建 | 第41-43页 |
| 3.2.3 p10和ph驱动的杂合载体的构建 | 第43-45页 |
| 3.3 不同拷贝数的重组病毒的构建 | 第45-46页 |
| 3.4 构建成功的杆状病毒的荧光照片 | 第46-48页 |
| 3.5 病毒基因组的提取 | 第48页 |
| 3.6 病毒滴度测定 | 第48-49页 |
| 3.7 SDS-PAGE检测不同拷贝数重组蛋白表达 | 第49-50页 |
| 3.8 WesternBlot检测重组蛋白的表达 | 第50-51页 |
| 3.9 重组S1蛋白的纯化 | 第51-52页 |
| 3.10 His标签ELISA检测试剂盒检测蛋白浓度 | 第52-54页 |
| 3.11 免疫鼠血清的抗体特异性检测 | 第54-57页 |
| 3.11.1 pET28a-PEDVS1的原核表达 | 第54页 |
| 3.11.2 原核表达的S1蛋白的纯化 | 第54-55页 |
| 3.11.3 特异性抗体检测结果 | 第55-57页 |
| 第四章 讨论 | 第57-59页 |
| 参考文献 | 第59-63页 |
| 附录 | 第63-64页 |
| 致谢 | 第64-65页 |
