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果蝇来源CRAC通道蛋白的表达与纯化

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果蝇来源CRAC通道蛋白的表达与纯化
论文目录
 
摘要第4-5页
Abstract第5-10页
1 文献综述第10-25页
  1.1 细胞内Ca~(2+)信号转导第10页
    1.1.1 细胞信号转导第10页
    1.1.2 细胞内Ca~(2+)的信号转导第10页
  1.2 Ca~(2+)释放激活Ca~(2+)通道(CRAC)及其特性第10-24页
    1.2.1 CRAC通道第10-11页
    1.2.2 Orai结构与功能第11-16页
      1.2.2.1 Orai蛋白的结构第11-13页
      1.2.2.2 Orai通道的门控第13-14页
      1.2.2.3 Orai通道的失活第14-16页
    1.2.3 STIM结构与功能第16-21页
      1.2.3.1 STIM蛋白的结构第16-17页
      1.2.3.2 STIM蛋白的功能第17-21页
    1.2.4 CRAC通道激活的分子机制及研究进展第21-24页
  1.3 论文的研究目标和意义第24-25页
2 材料与方法第25-52页
  2.1 实验材料第25-33页
    2.1.1 目的基因第25页
    2.1.2 质粒第25-27页
      2.1.2.1 本研究所用质粒第25-26页
      2.1.2.2 本研究中所构建的质粒第26-27页
    2.1.3 用于扩增和表达的大肠杆菌和酵母菌株第27-28页
    2.1.4 常用试剂和溶液的配制第28-31页
    2.1.5 实验主要仪器第31-33页
  2.2 实验方法第33-52页
    2.2.1 基因克隆第33-37页
      2.2.1.1 引物设计与合成第33页
      2.2.1.2 目的基因的扩增第33-35页
      2.2.1.3 PCR产物的电泳鉴定及回收第35页
      2.2.1.4 DNA片段和载体的双酶切第35-36页
      2.2.1.5 DNA目的片段和载体的连接与转化第36页
      2.2.1.6 重组质粒的提取第36-37页
    2.2.2 细胞培养、转染和荧光成像第37-38页
      2.2.2.1 细胞培养第37页
      2.2.2.2 转染第37-38页
      2.2.2.3 荧光成像第38页
    2.2.3 电生理(膜片钳技术)第38-39页
    2.2.4 目的蛋白E.coli表达系统的表达与纯化(STIM蛋白)第39-43页
      2.2.4.1 目的蛋白E.coli表达系统的小量表达第39页
      2.2.4.2 目的蛋白E.coli表达系统的大量表达第39-43页
    2.2.5 目的蛋白Pichia pastoris表达系统的表达与纯化(dOrai膜蛋白)第43-50页
      2.2.5.1 大量线性化载体制备第43-44页
      2.2.5.2 感受态细胞的制备及酵母细胞电转化第44-46页
      2.2.5.3 酵母表达系统的试表达第46-47页
      2.2.5.4 目标蛋白的大规模表达与纯化第47-50页
    2.2.6 等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry,ITC)第50-52页
      2.2.6.1 ITC作用原理第50-51页
      2.2.6.2 ITC样品准备第51-52页
3 利用Pichia pastoris过表达和分离纯化果蝇来源的膜蛋白dOrai第52-57页
  3.1 酵母阳性克隆的筛选第52-55页
    3.1.1 pPICZ A-Dr-Orai质粒的构建和提取第52-53页
    3.1.2 pPICZ A-Dr-Orai酵母阳性克隆表达筛选第53-55页
      3.1.2.1 pPICZ A-Dr-Orai酵母阳性克隆表达筛选原理及流程第53页
      3.2.1.2 pPICZ A-Dr-Orai酵母阳性克隆筛选结果第53-55页
  3.2 dOrai膜蛋白的大规模表达与分离纯化第55-57页
4 利用大肠杆菌过表达和分离纯化果蝇来源的STIM蛋白第57-64页
  4.1 分子克隆第57页
  4.2 果蝇源STIM蛋白的表达与纯化第57-61页
    4.2.1 果蝇源STIM蛋白的试表达第57-58页
    4.2.2 果蝇源STIM蛋白的大量表达第58-60页
    4.2.3 果蝇源STIM蛋白的大量表达条件优化第60-61页
  4.3 果蝇源STIM蛋白的功能测定第61-64页
    4.3.1 质粒构建和细胞转染第61-62页
    4.3.2 果蝇源STIM蛋白的荧光成像第62-63页
    4.3.3 电生理第63-64页
5 ITC相互作用分析第64-66页
  5.1 Dr-Orai蛋白与Dr-S403-555 蛋白ITC相互作用第64-65页
  5.2 Dr-Orai蛋白与Dr-S374-555 蛋白ITC相互作用第65-66页
6 讨论与展望第66-68页
参考文献第68-83页
致谢第83-85页
在学期间发表的学术论文与研究成果第85页

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