论文目录 | |
摘要 | 第10-11
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Abstract | 第11-13
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1 引言 | 第13-23
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· 抑制支链氨基酸生物合成途径除草剂靶标的研究进展 | 第13-15
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· 利用生物大分子筛选与其作用的活性小分子研究进展 | 第15-19
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· 利用生物大分子筛选与其作用的活性小分子的方法 | 第15-16
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· 药物与生物大分子相互作用研究进展 | 第16-19
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· 除草剂与拟南芥乙酰羟酸合成酶ATAHAS 相互作用的分子机理研究进展 | 第19-21
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· AtAHAS 的结构 | 第19-20
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· 磺酰脲与咪唑啉酮对AtAHAS 的作用 | 第20-21
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· 研究目的和实验内容 | 第21-23
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· 研究的目的和意义 | 第21-22
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· 课题来源和研究内容 | 第22-23
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2 实验材料和仪器 | 第23-27
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· 供试材料 | 第23
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· 基本试剂及生产厂家 | 第23-24
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· 拟南芥乙酰羟酸合成酶催化亚基的基因克隆与序列分析材料 | 第23
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· 乙酰羟酸合成酶催化亚基在大肠杆菌中的表达材料 | 第23
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· 毕赤酵母表达系统的构建材料 | 第23-24
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· 酶活测定与荧光分析材料 | 第24
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· 培养基及溶液 | 第24-25
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· 仪器与厂家 | 第25-27
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3 实验方法 | 第27-40
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· 拟南芥乙酰羟酸合成酶催化亚基的基因克隆与序列分析 | 第27-31
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· 总RNA 提取方法 | 第27
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· 总 RNA 质量检测 | 第27
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· 乙酰羟酸合成酶催化亚基cDNA 的合成 | 第27-28
页 |
· 乙酰羟酸合成酶催化亚基cDNA 的扩增 | 第28
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· PCR 产物的纯化 | 第28-29
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· JM 109 感受态细胞制备 | 第29
页 |
· 目的基因与克隆载体的连接及转化 | 第29-30
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· 阳性克隆的鉴定 | 第30
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· 目的基因的核苷酸序列测定 | 第30-31
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· 乙酰羟酸合成酶催化亚基在大肠杆菌中的表达、纯化活性分析 | 第31-34
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· 乙酰羟酸合成酶催化亚基在大肠杆菌中的表达 | 第31-32
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· 乙酰羟酸合成酶催化亚基蛋白的纯化 | 第32-33
页 |
· 包涵体复性 | 第33
页 |
· 乙酰羟酸合成酶活性分析 | 第33-34
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· 乙酰羟酸合成酶在毕赤酵母中的表达及粗酶液活性分析 | 第34-38
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· 乙酰羟酸合成酶在毕赤酵母中表达载体的构建 | 第34-36
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· 重组质粒的线性化 | 第36-37
页 |
· 乙酰羟酸合成酶催化亚基DNA 电转化法转化毕赤酵母 | 第37-38
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· AHAS 在毕赤酵母中的诱导表达 | 第38
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· 培养基中粗酶活性测定 | 第38
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· 乙酰羟酸合成酶农药先导化合物筛选方法的建立 | 第38-40
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· 通过酶活性测方法筛选农药先导化合物 | 第38-39
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· 荧光法筛选农药先导化合物 | 第39-40
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4 结果与分析 | 第40-64
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· 乙酰羟酸合成酶催化亚基 cDNA 的克隆与序列分析 | 第40-46
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· 总RNA 质量检测 | 第40
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· 乙酰羟酸合成酶催化亚基cDNA 的扩增 | 第40-41
页 |
· 阳性克隆PCR 的鉴定 | 第41-42
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· 基因测序与序列提交 | 第42-45
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· 同源性分析 | 第45
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· 乙酰羟酸合成酶软件预测分析 | 第45-46
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· 乙酰羟酸合成酶催化亚基的原核表达 | 第46-49
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· 表达载体构建所需的乙酰羟酸合成酶催化亚基基因的获取 | 第46
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· 重组质粒转化JM109 后的菌落PCR 鉴定及质粒酶切鉴定 | 第46-47
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· 乙酰羟酸合成酶催化亚基重组蛋白的SDS-PAGE 检测 | 第47-48
页 |
· 重组蛋白可溶性、纯化及复性的SDS-PAGE 检测 | 第48-49
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· 乙酰羟酸合成酶的真核表达 | 第49-53
页 |
· 表达载体构建所需的乙酰羟酸合成酶催化亚基基因的获取 | 第49
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· 载体与目的基因连接方向鉴定 | 第49-50
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· 重组载体的酶切鉴定 | 第50
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· 重组质粒转化毕赤酵母的鉴定 | 第50-52
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· 9K-AHAS 基因的诱导表达 | 第52-53
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· 乙酰羟酸合成酶活性测定 | 第53-54
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· 标准曲线的绘制 | 第53-54
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· 大肠杆菌表达产物复性后酶活测定结果 | 第54
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· 酵母表达培养基上清粗酶活性测定结果 | 第54
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· 乙酰羟酸合成酶与两种农药及农药单嘧磺隆中间体的相互作用 | 第54-59
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· 三维荧光光谱 | 第54-55
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· 氯嘧磺隆对乙酰羟酸合成酶的荧光猝灭 | 第55-57
页 |
· 氯嘧磺隆与乙酰羟酸合成酶的表观结合常数KA 以及结合位点数n | 第57-58
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· 氯嘧磺隆与乙酰羟酸合成酶上结合位置的求取 | 第58-59
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· 乙酰羟酸合成酶与咪草烟的相互作用 | 第59-62
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· 咪草烟对乙酰羟酸合成酶的荧光猝灭 | 第59-60
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· 咪草烟与乙酰羟酸合成酶的表观结合常数KA以及结合位点数n | 第60-61
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· 咪草烟与乙酰羟酸合成酶上结合位置的求取 | 第61-62
页 |
· 乙酰羟酸合成酶与药物单嘧磺隆中间体的作用 | 第62-64
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5 讨论 | 第64-67
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· 乙酰羟酸合成酶基因催化亚基的克隆 | 第64
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· 乙酰羟酸合成酶基因催化亚基的原核表达与纯化 | 第64
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· 乙酰羟酸合成酶基因催化亚基的真核表达 | 第64-65
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· 乙酰羟酸合成酶重组蛋白活性测定 | 第65-66
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· 乙酰羟酸合成酶农药先导化合物筛选方法的建立与验证 | 第66-67
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6 结论 | 第67-68
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致谢 | 第68-69
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参考文献 | 第69-74
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攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第74页 |