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小鼠瘦素(mLeptin)的体外表达、纯化及活性的研究

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小鼠瘦素(mLeptin)的体外表达、纯化及活性的研究
论文目录
 
中文摘要第1-5页
Abstract第5-11页
第一章 引言第11-26页
  · 研究背景及瘦素的发现第11-12页
  · 瘦素的基因结构第12-13页
  · 瘦素蛋白的结构及分布第13-14页
    · 瘦素蛋白的结构第13-14页
    · 瘦素的分布及影响因素第14页
  · 瘦素受体第14-15页
  · 瘦素的作用机制第15-17页
    · 瘦素与下丘脑第15-16页
    · 瘦素的信号传导机制第16-17页
  · 瘦素生物学功能及相关疾病第17-24页
    · 瘦素的生物学功能第17-21页
    · 瘦素与相关疾病第21-24页
  · 瘦素的应用前景第24-26页
    · 肥胖的基因治疗第24-25页
    · 重组瘦素蛋白治疗肥胖第25页
    · 重组瘦素蛋白治疗糖尿病患者第25-26页
第二章 重组表达载体 PET-28a(+)-His-mLeptin 的构建及在大肠杆菌中的诱导表达第26-45页
  · 材料与方法第27-37页
    · 菌种和质粒第27-28页
    · 试剂及相关工具酶第28页
    · 主要仪器第28页
    · 培养基及实验相关溶液的配制第28-30页
    · His-mleptin 基因片段的获得第30页
    · His-mleptin 目的片段的回收纯化第30-31页
    · T 载体的构建及验证第31页
    · DH5α和 BL21 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化第31-32页
    · 碱法抽提 His-mleptin-PMD19-TA 质粒 DNA 及 PET-28a(+)质粒 DNA第32-33页
    · His-mleptin-PMD19-TA 质粒及 PET28a(+)质粒的 EcoRⅠ和 XhoⅠ酶切第33-34页
    · 目的基因片段与 PET-28a(+)质粒片段的连接第34页
    · BL21 感受态细胞的制备及连接产物的转化(详见 2.1.8)第34页
    · 重组质粒的 PCR 鉴定、酶切验证及序列测定第34-35页
    · 工程菌株 BL21-pET28a-His-mleptin 的诱导表达第35-36页
    · SDS-PAGE 电泳分析第36页
    · SDS-PAGE 考马斯亮蓝凝胶染色与脱色及 LC-ESI-MS/MS 鉴定第36页
    · 工程菌株 BL21-pET28-His-mleptin 的保存第36-37页
  · 结果与讨论第37-45页
    · PCR 反应获得 His-mleptin 基因片段第37页
    · 重组表达载体 pET28a-His-mLep 的构建第37-38页
    · 重组表达载体的 pET28a-His-mLep 的鉴定第38-39页
    · 工程菌株 BL21-pET28a-His-mleptin 的诱导表达及 LC-ESI-MS 鉴定结果第39-43页
    · 讨论第43-45页
第三章 大肠杆菌包涵体的变性、复性及目的蛋白的纯化、生物活性检测第45-56页
  · 材料和方法第46-50页
    · 材料与主要试剂第46页
    · 主要仪器第46页
    · 试验相关溶液的配制第46-48页
    · 包涵体的提取和洗涤第48页
    · 包涵体的变性与复性第48页
    · 复性后纯化第48-49页
    · Ni-NTA-琼脂糖的再生第49-50页
    · 纯化后的目的蛋白溶液 BCA 法测蛋白浓度第50页
    · 纯化后目的蛋白 His-mleptin 的生物活性检测第50页
  · 结果与讨论第50-55页
    · 包涵体的提取第50-51页
    · 变性溶液缓慢复性结果第51-52页
    · 复性后的 His-mleptin 溶液经 Ni-NTA 琼脂糖亲和层析第52页
    · BCA 蛋白浓度检测第52-53页
    · 重组 mleptin 生物活性检测第53-55页
  · 讨论第55-56页
第四章 重组表达载体 pPICZα-His-mLeptin 的构建及在毕赤酵母中的表达第56-68页
  · 材料与方法第57-65页
    · 菌种和质粒第57页
    · 试剂与相关工具酶第57页
    · 主要仪器设备第57-58页
    · 培养基及实验相关溶液的配制第58页
    · His-mleptin 基因片段的获得第58-59页
    · His-mleptin 目的片段的回收纯化第59页
    · 纯化的 His-mleptin 与 T 载体的连接第59页
    · Top10 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化第59-60页
    · 重组质粒 His-mleptin-PMD19-T 以及表达载体 pPICZα质粒的抽提第60页
    · His-mleptin-PMD19-T 质粒及 pPICZα质粒的 EcoRⅠ和 XbaⅠ酶切第60-61页
    · 目的基因 His-mleptin 片段与 pPICZα质粒的连接第61页
    · 重组质粒 pPICZα-His-mleptin 的转化和验证第61-62页
    · 用于酵母转化 DNA 的制备第62页
    · 毕赤酵母 GS115 的电转化第62-63页
    · 毕赤酵母 GS115 重组转化子的验证第63页
    · 重组毕赤酵母菌株的表达第63-64页
    · SDS-PAGE 电泳分析第64-65页
    · SDS-PAGE 考马斯亮蓝凝胶染色与脱色第65页
  · 结果与讨论第65-68页
    · PCR 反应获得 His-mleptin 基因片段第65页
    · 重组表达载体的 pPICZα-His-mLep 的鉴定第65-66页
    · 工程菌的诱导表达结果第66-67页
    · 讨论第67-68页
第五章 不同碳源下毕赤酵母 GS115 蛋白组学分析第68-82页
  · 材料与方法第69-72页
    · 菌种第69页
    · 主要试剂和仪器第69-70页
    · 各种溶液及培养基的配制第70页
    · GS115 上清蛋白和菌体蛋白样品的准备第70-71页
    · 蛋白样品的 SDS-PAGE 及割胶第71页
    · 进行 LC-ESI-MS/MS 分析前样品的处理第71-72页
    · 归一化非标定量方法确定蛋白含量第72页
  · 实验结果第72-77页
    · LC-ESI-MS/MS 分析结果第72-77页
  · 讨论第77-82页
第六章 总结及展望第82-84页
参考文献第84-92页
攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文第92-93页
致谢第93-94页

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