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高产菊粉内切酶多拷贝基因工程菌株的构建和表达研究

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高产菊粉内切酶多拷贝基因工程菌株的构建和表达研究
论文目录
 
摘要第1-10页
ABSTRACT第10-13页
第1章 绪论第13-25页
  1.1 菊粉和菊粉酶第13-14页
  1.2 菊粉酶的来源和生产第14-17页
  1.3 低聚果糖第17-18页
  1.4 巴斯德毕赤酵母表达系统第18-20页
    1.4.1 毕赤酵母表达系统的组成第18-19页
    1.4.2 毕赤酵母表达系统的优势第19-20页
    1.4.3 毕赤酵母表达系统在菊粉内切酶生产中的应用研究进展第20页
  1.5 菊粉内切酶的分子水平研究现状第20-21页
  1.6 本论文的研究内容和意义第21-25页
第2章 菊粉内切酶基因INU2在毕赤酵母GS115中表达与研究第25-49页
  2.1 前言第25页
  2.2 材料与方法第25-38页
    2.2.1 菌株与质粒第25页
    2.2.2 酶、药品和试剂盒第25-26页
    2.2.3 主要实验器材第26-27页
    2.2.4 培养基和试剂配制第27-30页
    2.2.5 试验方法第30-38页
  1. 无花果曲霉基因组的提取第30页
  2. 菊粉内切酶基因inu2的克隆第30页
  3. 重组质粒pPIC9K-INU2的构建第30-32页
  4. 重组质粒pPIC9K-INU2的验证第32-33页
  5. 重组质粒线性化第33-34页
  6. 毕赤酵母GS115感受态的制备及其电转第34-35页
  7. 转化子筛选第35页
  8. 阳性转化子的诱导表达第35页
  9. 菊粉酶酶活性的测定第35-36页
  10. 菊粉内切酶INU2的底物特异性检测第36-37页
  11. SDS-PAGE电泳检测第37-38页
  2.3 结果与讨论第38-48页
    2.3.1 无花果曲霉(Aspergillus ficuum)基因组DNA的提取第38页
    2.3.2 菊粉内切酶基因的克隆第38-39页
    2.3.3 重组质粒pPIC9K-INU2的构建第39-40页
    2.3.4 重组质粒pPIC9K-INU2的验证第40-44页
    2.3.5 转化子的菌落PCR验证第44页
    2.3.6 阳性转化子的诱导表达第44-45页
    2.3.7 重组表达酶INU2的底物特异性检测第45-46页
    2.3.8 重组表达酶INU2的SDS-PAGE电泳验证第46页
    2.3.9 重组INU2和INU3的分子结构分析第46-48页
  2.4 本章小结第48-49页
第3章 多拷贝菊粉内切酶基因工程菌的筛选及其高密度发酵第49-59页
  3.1 前言第49页
  3.2 材料和方法第49-54页
    3.2.1 菌株和质粒第49页
    3.2.2 酶、药品和试剂盒第49-50页
    3.2.3 主要实验器材第50页
    3.2.4 培养基和试剂配制第50-51页
    3.2.5 试验方法第51-54页
  1. 筛选不同遗传霉素G418抗性的转化子第51页
  2. 实时荧光定量PCR确定转化子的inu2拷贝数第51-53页
  3. 多拷贝转化子的摇瓶发酵第53页
  4. 3L发酵罐分批补料培养第53-54页
  3.3 结果与讨论第54-58页
    3.3.1 筛选G418抗性的转化子第54-55页
    3.3.2 实时荧光定量PCR确定转化子的INU2拷贝数第55-56页
    3.3.3 多拷贝转化子酶活力比较第56-57页
    3.3.4 转化子INU2-3的高密度发酵第57-58页
  3.4 本章小结第58-59页
第4章 双启动子多拷贝菊粉内切酶基因工程菌的构建及其发酵菊粉酶液的分离纯化和特性研究第59-81页
  4.1 前言第59页
  4.2 材料和方法第59-68页
    4.2.1 菌株和质粒第59页
    4.2.2 酶、药品和试剂盒第59-60页
    4.2.3 主要实验器材第60页
    4.2.4 培养基和试剂配制第60页
    4.2.5 试验方法第60-68页
  1. 多拷贝重组质粒pGAPZαA-3INU2的构建第60-64页
  2. 重组毕赤酵母INU2-3感受态的制备及电转化第64页
  3. 双启动子转化子的验证第64页
  4. 双启动子转化子中INU2拷贝数的确定第64页
  5. 双启动子转化子的高密度发酵第64-65页
  6. 重组酶INU2对底物菊粉的最适pH反应条件研究第65页
  7. 重组酶INU2对底物菊粉的最适温度反应条件研究第65页
  8. 酶解菊粉产物薄层层析第65页
  9. 粗酶液的蛋白盐析第65-67页
  10. 重组菊粉内切酶INU2保护剂的研究第67-68页
  4.3 结果与讨论第68-80页
    4.3.1 多拷贝重组质粒pGAPZαA-3INU2的构建第68-70页
  1. 重组质粒pGAPZαA-INU2的构建第68页
  2. 2拷贝重组质粒pGAPZαA-2INU2的构建第68-69页
  3. 3拷贝重组质粒pGAPZαA-3INU2的构建第69-70页
    4.3.2 双启动子工程菌株的构建第70页
    4.3.3 双启动子转化子的验证第70-71页
    4.3.4 双启动子转化子中INU2拷贝数的确定第71页
    4.3.5 转化子INU2-A3-G2的高密度发酵第71-72页
    4.3.6 重组酶INU2对底物菊粉的最适pH反应条件研究第72-73页
    4.3.7 重组酶INU2对底物菊粉的最适温度反应条件研究第73-74页
    4.3.8 重组酶酶解菊粉产物的薄层层析第74页
    4.3.9 粗酶液的蛋白盐析第74-76页
  1. 硫酸铵盐析的最适pH选择第75页
  2. 盐析的最适硫酸铵饱和度选择第75-76页
    4.3.10 重组菊粉内切酶INU2保护剂的研究第76-80页
  1. 盐类(CaCl_2,MgSO_4,KCl,NaCl)对酶热稳定性影响第76页
  2. 糖类(葡萄糖,果糖,蔗糖,海藻糖)对酶热稳定性影响第76-77页
  3. 醇类(山梨醇,甘油,丙二醇,聚乙二醇,甘露醇)对酶热稳定影响第77-78页
  4. 复合保护剂配比的正交设计第78-80页
  4.4 本章小节第80-81页
总结和创新点第81-83页
  1.1 论文总结第81-82页
  1.2 论文创新点第82-83页
参考文献第83-89页
在读期间发表的文章和奖励第89-91页
致谢第91-92页
附件第92页

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