论文目录 | |
| 摘要 | 第1-5
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| Abstract | 第5-11
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| 引言 | 第11-13
页 |
| 第一部分 前言 | 第13-20
页 |
| 1 IBDV的结构及其基因组 | 第13
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| 2 IBDV的衣壳蛋白 | 第13-15
页 |
| 3 IBDV的转录、复制、装配与释放 | 第15-16
页 |
| 4 IBDV的致病机理 | 第16-17
页 |
| 5 IBDV的毒力变化与细胞适应性 | 第17-20
页 |
| · VP2与病毒毒力 | 第17-18
页 |
| · VP2与病毒的细胞适应性 | 第18-20
页 |
| 第二部分 IBDV VP2基因片段的噬菌体展示及重组噬菌体与细胞的结合鉴定 | 第20-45
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| 1 材料与方法 | 第20-29
页 |
| · VP2基因、载体 | 第20-21
页 |
| · 试剂配制 | 第21
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| · VP2基因的扩增 | 第21
页 |
| · VP2基因的克隆 | 第21-24
页 |
| · PCR产物回收 | 第21-22
页 |
| · 大肠杆菌JM109感受态的制备 | 第22
页 |
| · 转化 | 第22
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| · 阳性转化子的筛选与鉴定 | 第22-24
页 |
| · 序列测定与分析 | 第24
页 |
| · VP2基因分段 | 第24-25
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| · VP2基因及其片段的噬菌体包装 | 第25-26
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| · VP2基因及其片段的酶切与回收 | 第25
页 |
| · 噬菌体包装 | 第25-26
页 |
| · 重组噬菌体的滴度测定 | 第26
页 |
| · 重组噬菌体的鉴定 | 第26-27
页 |
| · 重组噬菌体的PCR鉴定 | 第26-27
页 |
| · 序列测定 | 第27
页 |
| · 重组噬菌体扩大培养及纯化 | 第27-28
页 |
| · 噬菌体的扩大培养与保存 | 第27
页 |
| · 重组噬菌体的纯化 | 第27
页 |
| · 纯化噬菌体的鉴定 | 第27-28
页 |
| · 重组噬菌体的FITC标记 | 第28
页 |
| · 荧光标记的重组噬菌体与IBDV易感细胞的结合 | 第28-29
页 |
| · 鸡法氏囊B细胞,Vero细胞的制备 | 第28-29
页 |
| · B细胞、Vero细胞与FITC标记噬菌体的结合 | 第29
页 |
| 2 结果 | 第29-40
页 |
| · VP2基因的扩增 | 第29-30
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| · 重组质粒PCR与酶切鉴定 | 第30
页 |
| · VP2基因的分段 | 第30-31
页 |
| · 噬菌体包装及重组噬菌体鉴定 | 第31-32
页 |
| · 噬菌体纯化结果 | 第32-33
页 |
| · 噬菌体FITC标记结果 | 第33-34
页 |
| · 荧光标记重组噬菌体于B细胞的结合 | 第34-37
页 |
| · 荧光标记的重组噬菌体与B细胞涂片结合的荧光检测 | 第34-35
页 |
| · 荧光标记的重组噬菌体与B细胞悬液结合的流式细胞分析 | 第35-37
页 |
| · 荧光标记重组噬菌体于Vero细胞的结合 | 第37-40
页 |
| · 荧光标记的重组噬菌体与Vero细胞涂片结合的荧光检测 | 第37-38
页 |
| · 荧光标记的重组噬菌体与B细胞悬液结合的流式细胞分析 | 第38-40
页 |
| 3 讨论 | 第40-45
页 |
| · VP2蛋白的分段 | 第40-42
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| · 荧光标记的重组噬菌体制备 | 第42-43
页 |
| · 荧光噬菌体与B细胞及Vero细胞的结合 | 第43-45
页 |
| 第三部分 VP2基因片段与的GFP融合分子在COS7细胞中的表达及与细胞的结合鉴定 | 第45-60
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| 1 材料与方法 | 第45-52
页 |
| · 细胞、质粒和试剂 | 第45-46
页 |
| · 真核表达质粒pGFP-VP2/B/B1/B2/B3的构建 | 第46-48
页 |
| · VP2基因及其片段的扩增 | 第46-47
页 |
| · VP2基因片段的克隆 | 第47-48
页 |
| · 细胞瞬时转染 | 第48-50
页 |
| · 质粒制备 | 第48-49
页 |
| · COS7细胞培养和转染 | 第49-50
页 |
| · 荧光显微镜下观察和照相 | 第50
页 |
| · 细胞稳定转染 | 第50-51
页 |
| · G418工作浓度的确定 | 第50
页 |
| · 质粒制备 | 第50
页 |
| · 细胞转染 | 第50-51
页 |
| · 阳性细胞的克隆化 | 第51
页 |
| · 细胞冻存 | 第51
页 |
| · 表达蛋白收集与纯化 | 第51
页 |
| · 表达蛋白纯化 | 第51
页 |
| · 纯化蛋白与IBDV易感细胞的结合 | 第51-52
页 |
| 2 结果 | 第52-57
页 |
| · VP2及其片段的PCR扩增 | 第52
页 |
| · 重组载体pGFP-VP2/B/B1/B2/B3的鉴定 | 第52-53
页 |
| · 重组质粒在COS7细胞中的瞬时表达 | 第53-54
页 |
| · 重组质粒在COS7细胞中的稳定表达 | 第54-55
页 |
| · GFP-VP2与GFP-B融合蛋白的纯化及鉴定 | 第55-56
页 |
| · 纯化蛋白与IBDV易感细胞的结合 | 第56-57
页 |
| 3 讨论 | 第57-60
页 |
| · GFP融合蛋白 | 第57
页 |
| · COS7细胞 | 第57
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| · 细胞转染及稳定表达外源蛋白细胞系的建立 | 第57-58
页 |
| · 融合蛋白的纯化及与细胞的结合实验 | 第58-60
页 |
| 第四部分 重叠多肽扫描鉴定VP2与细胞结合表位 | 第60-72
页 |
| 1 材料与方法 | 第60-62
页 |
| · 主要仪器 | 第60
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| · 多肽的合成 | 第60-61
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| · VP2重叠多肽设计 | 第60-61
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| · VP2重叠多肽合成 | 第61
页 |
| · 多肽对荧光标记的T7-VP2结合细胞的抑制 | 第61-62
页 |
| · 细胞制备 | 第61
页 |
| · 细胞结合抑制多肽的筛选 | 第61
页 |
| · 阳性多肽抑制浓度的确定 | 第61-62
页 |
| 2 结果 | 第62-69
页 |
| · 多肽设计与合成 | 第62
页 |
| · 多肽对荧光标记的T7-VP2结合细胞的抑制 | 第62-69
页 |
| · 多肽对B细胞结合T7-VP2的抑制 | 第62-65
页 |
| · 多肽对Vero细胞结合T7-VP2的抑制 | 第65-67
页 |
| · 阳性肽抑制浓度的筛选 | 第67-69
页 |
| 3 讨论 | 第69-72
页 |
| · 多肽的设计、合成与检测 | 第69-70
页 |
| · 合成多肽与细胞的结合鉴定 | 第70-72
页 |
| 全文总结 | 第72-73
页 |
| 参考文献 | 第73-78
页 |
| 致谢 | 第78-79
页 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 | 第79页 |
