论文目录 | |
| 摘要 | 第11-12页 |
| ABSTRACT | 第12-14页 |
| 缩略词表 | 第14-15页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-27页 |
| 1 引言 | 第15页 |
| 2 启动子简介 | 第15-22页 |
| 2.1 启动子的结构 | 第15-17页 |
| 2.2 启动子的研究方法 | 第17-20页 |
| 2.2.1 基于生物信息学的启动子分析 | 第17-18页 |
| 2.2.2 启动子克隆方法 | 第18-19页 |
| 2.2.3 研究启动子功能的实验方法 | 第19-20页 |
| 2.3 启动子的应用 | 第20-22页 |
| 2.3.1 应用于转基因动物 | 第20页 |
| 2.3.2 应用于RNA干扰 | 第20-21页 |
| 2.3.3 临床治疗中的应用 | 第21-22页 |
| 3 MyoG/α1-AT启动子及CKM增强子研究进展 | 第22-23页 |
| 3.1 MyoG启动子研究进展 | 第22页 |
| 3.2 α1-AT启动子研究进展 | 第22-23页 |
| 3.3 CKM增强子研究现状 | 第23页 |
| 4 PPARγ的概述 | 第23-24页 |
| 5 BGL1研究现状 | 第24-25页 |
| 6 研究目的和意义 | 第25-27页 |
| 第二章 材料与方法 | 第27-51页 |
| 1 试验材料 | 第27-29页 |
| 1.1 DNA样品 | 第27页 |
| 1.2 载体和菌株 | 第27页 |
| 1.3 试剂及其配置 | 第27-28页 |
| 1.3.1 主要试剂 | 第27-28页 |
| 1.3.2 试剂的配置 | 第28页 |
| 1.4 主要数据库及分析软件 | 第28-29页 |
| 2 试验方法 | 第29-51页 |
| 2.1 猪MyoG基因启动子的克隆及重组表达质粒的构建 | 第29-34页 |
| 2.1.1 猪基因组提取DNA及质量鉴定 | 第29页 |
| 2.1.2 猪MyoG调控序列的获得 | 第29-30页 |
| 2.1.3 PCR扩增产物的检测和回收 | 第30页 |
| 2.1.3.1 PCR产物的检测 | 第30页 |
| 2.1.3.2 PCR产物的回收及纯化 | 第30页 |
| 2.1.4 克隆载体的构建及酶切回收 | 第30-32页 |
| 2.1.4.1 PCR产物连接pMD18-T | 第30-31页 |
| 2.1.4.2 重组质粒转化 | 第31页 |
| 2.1.4.3 阳性克隆的检测及测序 | 第31页 |
| 2.1.4.4 连接pMD18-T质粒小量提取 | 第31-32页 |
| 2.1.5 pGL3-MyoG重组表达质粒的构建 | 第32-34页 |
| 2.1.5.1 pMD18-T及pGL3-Basic载体双酶切及回收 | 第32-33页 |
| 2.1.5.2 pGL3-Basic重组表达质粒的构建 | 第33页 |
| 2.1.5.3 重组质粒的去内毒素小量提取及双酶切鉴定 | 第33-34页 |
| 2.2 细胞培养及诱导分化 | 第34-35页 |
| 2.2.1 细胞的复苏 | 第34页 |
| 2.2.2 细胞的常规培养 | 第34-35页 |
| 2.2.3 细胞冻存 | 第35页 |
| 2.2.4 C2C12细胞的诱导分化 | 第35页 |
| 2.3 细胞转染及双荧光素酶活性的测定 | 第35-37页 |
| 2.3.1 细胞的转染 | 第35-36页 |
| 2.3.2 双荧光素酶相对活性的检测 | 第36页 |
| 2.3.2.1 细胞裂解 | 第36页 |
| 2.3.2.2 双荧光素酶活性的检测及计算 | 第36页 |
| 2.3.3 数据的处理及分析 | 第36-37页 |
| 2.4 真核表达载体以及MyoG突变载体构建 | 第37-38页 |
| 2.4.1 转录因子MyoD真核表达质粒的鉴定 | 第37页 |
| 2.4.2 pcDNA3.1-EGFP真核表达质粒的构建 | 第37页 |
| 2.4.3 MyoG突变载体的构建 | 第37-38页 |
| 2.5 EMSA验证MyoD结合位点的存在 | 第38-41页 |
| 2.5.1 制备探针 | 第38页 |
| 2.5.2 核蛋白提取 | 第38-39页 |
| 2.5.3 凝胶迁移试验 | 第39-41页 |
| 2.6 MyoG启动子与PPARy重组质粒的构建 | 第41-42页 |
| 2.6.1 猪PPARγ基因CDS区域的克隆 | 第41页 |
| 2.6.2 PPARγ与pGL3-MyoG重组质粒的鉴定 | 第41-42页 |
| 2.7 PPARγ基因在C2C12细胞中表达量的测定 | 第42-46页 |
| 2.7.1 小鼠C2C12细胞RNA的提取及反转录 | 第42-43页 |
| 2.7.2 定量PCR分析PPARγ在C2C12细胞中的表达量 | 第43-44页 |
| 2.7.3 C2C12细胞蛋白质的提取 | 第44页 |
| 2.7.4 Western Blot检测目的蛋白质的表达量 | 第44-46页 |
| 2.7.4.1 SDS-PAGE电泳 | 第44-45页 |
| 2.7.4.2 转膜 | 第45页 |
| 2.7.4.3 抗原抗体免疫反应 | 第45-46页 |
| 2.8 肌肉特异性表达外源基因转基因小鼠的制备与鉴定 | 第46页 |
| 2.8.1 转基因小鼠的制备 | 第46页 |
| 2.8.2 阳性鼠的PCR鉴定 | 第46页 |
| 2.9 嵌合启动子构建 | 第46-47页 |
| 2.9.1 猪CKM增强子的获得 | 第46-47页 |
| 2.9.1 猪Enhancer-Promoter嵌合启动子的构建 | 第47页 |
| 2.10 猪α1-AT基因启动子的克隆及重组表达质粒的构建 | 第47-48页 |
| 2.10.1 猪α1-AT调控序列的获得 | 第47-48页 |
| 2.10.2 pGL3-Basic重组表达质粒的构建 | 第48页 |
| 2.11 α1-AT启动子与BGL1重组质粒的构建 | 第48-49页 |
| 2.11.1 α1-AT基因信号肽的克隆 | 第48-49页 |
| 2.11.2 BGL1基因CDS区域的克隆 | 第49页 |
| 2.11.3 pGL3-AT-Signal-BGL1重组质粒的构建 | 第49页 |
| 2.12 BGL1基因在Hepa1-6细胞中表达量的测定 | 第49-51页 |
| 2.12.1 定量PCR分析BGL1在Hepa1-6细胞中的表达量 | 第49-50页 |
| 2.12.2 Western Blot检测BGL1蛋白质的表达量 | 第50-51页 |
| 第三章 结果与分析 | 第51-72页 |
| 第一部分 | 第51-67页 |
| 1 猪MyoG调控序列功能分析 | 第51-59页 |
| 1.1 猪MyoG调控区域的生物信息学分析 | 第51-53页 |
| 1.1.1 猪MyoG调控区域的结构预测 | 第51-53页 |
| 1.2 猪MyoG启动子克隆及重组质粒的构建 | 第53-54页 |
| 1.3 C2C12细胞的诱导分化 | 第54页 |
| 1.4 pGL3-MyoG-Basic质粒的双荧光素酶活性检测 | 第54-56页 |
| 1.5 转录因子MyoD对MyoG启动子的调控作用 | 第56-59页 |
| 1.5.1 转录因子MyoD真核表达载体与启动子片段共转染 | 第56-57页 |
| 1.5.2 转录因子MyoD真核表达载体与MyoG突变载体共转染 | 第57-58页 |
| 1.5.3 EMSA验证MyoD结合位点的存在 | 第58-59页 |
| 2 PPARγ表达载体的构建及其表达量测定 | 第59-64页 |
| 2.1 PPARγ表达载体的构建 | 第59-60页 |
| 2.2 QPCR检测PPARγ在C2C12细胞中的表达量 | 第60-62页 |
| 2.3 Western Blot检测PPARγ蛋白质在C2C12细胞中的表达量 | 第62-63页 |
| 2.4 转基因小鼠的获得 | 第63-64页 |
| 2.4.1 转基因小鼠PCR检测 | 第64页 |
| 3 猪CKM增强子活性的验证 | 第64-67页 |
| 3.1 含有Enhancer-Promoter载体的构建 | 第64-67页 |
| 第二部分 | 第67-72页 |
| 1 猪α1-AT基因调控序列功能分析 | 第67-69页 |
| 1.1 猪α1-AT调控区域的生物信息学分析 | 第67-68页 |
| 1.2 猪α1-AT启动子克隆及缺失重组质粒的构建 | 第68-69页 |
| 1.3 α1-AT缺失重组质粒的双荧光素酶活性检测 | 第69页 |
| 2 BGL1基因表达载体的构建及其表达量测定 | 第69-72页 |
| 2.1 BGL1表达载体的构建 | 第69-70页 |
| 2.2 QPCR检测BGL1在Hepa1-6细胞中的表达量 | 第70-71页 |
| 2.3 Western Blot检测蛋白质BGL1在Hepa1-6细胞中的表达量 | 第71-72页 |
| 第四章 讨论 | 第72-79页 |
| 1 启动子的组织特异性研究 | 第72-73页 |
| 2 启动子分析 | 第73-75页 |
| 2.1 猪MyoG启动子的活性分析 | 第73-74页 |
| 2.2 转录因子MyoD对启动子活性的影响 | 第74-75页 |
| 2.3 α1-AT启动子的活性分析 | 第75页 |
| 3 猪CKM增强子功能分析 | 第75-76页 |
| 4 异位表达PPARγ对骨骼肌的影响 | 第76-77页 |
| 5 肝脏特异性表达BGL1基因的意义 | 第77-79页 |
| 第五章 小结 | 第79-81页 |
| 1 本研究取得的成果 | 第79-80页 |
| 2 下一步工作计划 | 第80-81页 |
| 参考文献 | 第81-89页 |
| 致谢 | 第89页 |
