论文目录 | |
中文摘要 | 第1-6
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英文摘要 | 第6-12
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文献综述 | 第12-31
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第一章 猪瘟病毒研究进展 | 第12-26
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· 猪瘟概述 | 第12-13
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· 猪瘟病毒 | 第13-14
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· CSFV 的形态 | 第13
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· CSFV 的理化特征 | 第13
页 |
· CSFV 的抗原性、毒力和分型 | 第13-14
页 |
· CSFV 的培养细胞 | 第14
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· CSFV 的分子生物学研究 | 第14-26
页 |
· CSFV 的基因组结构 | 第14
页 |
· 非翻译区 | 第14-19
页 |
· 5’-UTR | 第15-17
页 |
· 3’-UTR | 第17-19
页 |
· N53 蛋白 | 第19-22
页 |
· NS3 蛋白的蛋白酶功能 | 第19-20
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· NS3 蛋白的NTPASE/HELICASE 功能 | 第20-21
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· NS3 蛋白的其他研究 | 第21-22
页 |
· NS3 与致细胞病变型病毒 | 第22-26
页 |
第二章 RNA 干扰抗病毒的研究进展 | 第26-31
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· RNA 干扰的发现 | 第26
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· RNA 干扰的机制 | 第26-27
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· RNAI 的特征 | 第27
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· RNA 干扰的抗病毒应用 | 第27-29
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· 以阻断宿主细胞表面受体功能抗病毒感染 | 第28
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· 以抑制病毒复制抗病毒感染 | 第28-29
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· RNAI 抗病毒作用面临的挑战 | 第29-30
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· 病毒基因组核苷酸的快速变异介导的RNAI 屏蔽作用 | 第29-30
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· 病毒产生蛋白质介导的RNAI 屏蔽作用 | 第30
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· 病毒核衣壳介导的RNAI 屏蔽作用 | 第30
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· 局部RNA 空间结构改变介导的RNAI 屏蔽作用 | 第30
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· 病毒逃逸 | 第30
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· 针对RNAI 抗性的一些解决办法 | 第30-31
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试验研究 | 第31-66
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第三章 CSFV SHIMEN 株 N53 基因真核表达载体的构建与纯化 | 第31-44
页 |
· 材料 | 第31-33
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· 质粒与菌株 | 第31
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· 工具酶和主要试剂 | 第31-33
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· 载体构建用工具酶和试剂 | 第31
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· LB 培养基 | 第31-32
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· 溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ | 第32
页 |
· 饱和平衡酚/氯仿/异戊醇 | 第32
页 |
· 10×TE、50×TAE 缓冲液 | 第32
页 |
· 质粒纯化试剂 | 第32
页 |
· 细胞培养用试剂 | 第32-33
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· 细胞消化试剂 ATV | 第33
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· 主要仪器与设备 | 第33
页 |
· 方法与步骤 | 第33-38
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· NS3 片段的扩增与回收 | 第33-35
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· CSFV 总RNA 的提取 | 第33-34
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· 引物的设计与合成 | 第34
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· RT-PCR 扩增 | 第34-35
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· PCR 产物的回收 | 第35
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· 目的基因的克隆 | 第35-36
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· PCR 产物与PMD19-T SIMPLER VECTOR 的连接 | 第35
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· 感受态细胞的制备 | 第35
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· 连接产物的转化 | 第35-36
页 |
· 重组质粒的提取与鉴定 | 第36-37
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· 重组质粒的提取 | 第36
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· 重组质粒的鉴定 | 第36-37
页 |
· 重组表达载体的构建与鉴定 | 第37
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· 阳性重组表达质粒及PEGFP-C1 质粒的纯化 | 第37-38
页 |
· 结果 | 第38-41
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· RT-PCR 产物的电泳结果 | 第38
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· 目的片段的克隆与鉴定 | 第38-41
页 |
· 重组质粒酶切鉴定结果 | 第38-39
页 |
· 重组质粒的测序鉴定结果 | 第39-41
页 |
· 重组表达质粒的鉴定与纯化结果 | 第41
页 |
· 重组表达质粒的酶切鉴定结果 | 第41
页 |
· 重组表达质粒及PEGFP-C1 质粒的纯化结果 | 第41
页 |
· 讨论 | 第41-43
页 |
· RT-PCR NS3 基因 | 第41-42
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· PMD19-T SIMPLER VECTOR 和PEGFP-C1 | 第42
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· 质粒纯化 | 第42-43
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· 小结 | 第43-44
页 |
第四章 CSFV NS3 蛋白的表达及对 PK-15 细胞作用的研究 | 第44-57
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· 材料 | 第44-45
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· 质粒与细胞 | 第44-45
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· 主要试剂 | 第45
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· 仪器设备 | 第45
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· 方法与步骤 | 第45-49
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· 新霉素(G418)最佳筛选浓度的确定 | 第45
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· PEGFP-N53 及PEGFP-C1 质粒转染 PK-15 细胞 | 第45-46
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· G418 筛选及阳性细胞的获得 | 第46
页 |
· 表达蛋白的检测 | 第46-49
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· SDS-PAGE 电泳 | 第46-48
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· WESTERN BLOT 分析 | 第48-49
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· N53 蛋白对宿主细胞PK-15 的作用研究 | 第49
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· 显微镜检测 | 第49
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· 细胞凋亡检测 | 第49
页 |
· 结果 | 第49-53
页 |
· 新霉素(G418)对PK-15 细胞最佳筛选浓度的确定 | 第49
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· 转染成功的鉴定及转染条件的确定 | 第49-50
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· 转染后阳性细胞的获得 | 第50-51
页 |
· 转染后NS3 表达蛋白检测结果 | 第51
页 |
· NS3 表达蛋白的SDS-PAGE 结果 | 第51
页 |
· NS3 表达蛋白的WESTERN-BLOT 结果 | 第51
页 |
· NS3 蛋白对宿主细胞PK-15 的作用研究结果 | 第51-53
页 |
· 显微镜观察结果 | 第51-52
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· 细胞凋亡检测 | 第52-53
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· 讨论 | 第53-56
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· 脂质体介导的基因转染 | 第53-54
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· G418 抗性筛选 | 第54
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· 表达NS3 蛋白阳性细胞的获得 | 第54-55
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· NS3 蛋白与细胞凋亡 | 第55-56
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· 小结 | 第56-57
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第五章 转录靶向CSFV 3’-UTR SHRNA 细胞株的建立 | 第57-66
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· 材料 | 第58
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· 质粒、毒株、菌株与细胞 | 第58
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· 工具酶及主要试剂 | 第58
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· 仪器与设备 | 第58
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· 方法与步骤 | 第58-60
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· 猪瘟病毒3’-UTR 干扰片段的设计 | 第58-59
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· 重组干扰质粒的构建与鉴定 | 第59
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· 重组干扰质粒的纯化 | 第59
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· 重组干扰质粒的转染 | 第59
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· G418 筛选及阳性细胞的获得 | 第59
页 |
· 稳定转录靶向猪瘟病毒3’-UTR SHRNA PK-15 细胞株的获得 | 第59-60
页 |
· 结果 | 第60-63
页 |
· 重组干扰质粒的鉴定 | 第60
页 |
· 重组干扰质粒的纯化 | 第60-61
页 |
· 重组干扰质粒转染结果 | 第61
页 |
· G418 筛选及阳性细胞的获得 | 第61-62
页 |
· 转录靶向猪瘟病毒3’-UTR SHRNA PK-15 细胞株的获得 | 第62-63
页 |
· 讨论 | 第63-65
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· SIRNA 的制备 | 第63-64
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· 靶向CSFV 3’-UTR 干扰位点的选择 | 第64-65
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· 小结 | 第65-66
页 |
结论 | 第66-67
页 |
参考文献 | 第67-76
页 |
致谢 | 第76-77
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个人简介 | 第77
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