论文目录 | |
| 中文摘要 | 第1-3页 |
| Abstract | 第3-5页 |
| 中文文摘 | 第5-13页 |
| 绪论 | 第13-21页 |
| 第一章 构建瞬时转染CRISPR/Cas9系统并用于制备弱毒活疫苗 | 第21-41页 |
| 1 材料与方法 | 第21-31页 |
| 1.1 实验材料 | 第21页 |
| 1.2 实验仪器 | 第21-22页 |
| 1.3 实验方法 | 第22-31页 |
| 1.3.1 种毒扩大培养 | 第22-23页 |
| 1.3.2 设计相应的sgRNA与验证引物 | 第23-24页 |
| 1.3.3 sgRNA退火 | 第24-25页 |
| 1.3.4 pX459载体的酶切及酶切产物回收 | 第25-27页 |
| 1.3.5 构建用于瞬时转染的CRISPR/Cas9基因编辑系统 | 第27-28页 |
| 1.3.6 病毒侵染转染后的ST细胞 | 第28-31页 |
| 2 结果 | 第31-39页 |
| 2.1 传代时细胞汇合度 | 第31页 |
| 2.2 收毒时细胞病变 | 第31-32页 |
| 2.3 pX459质粒的酶切 | 第32页 |
| 2.4 单一菌落测序 | 第32-33页 |
| 2.5 质粒转染ST细胞 | 第33-34页 |
| 2.6 病毒基因组PCR产物凝胶电泳 | 第34-35页 |
| 2.7 病毒基因组PCR产物测序 | 第35-36页 |
| 2.8 纯化后病毒基因组PCR产物凝胶电泳 | 第36-37页 |
| 2.9 纯化后病毒基因组PCR产物测序结果 | 第37-38页 |
| 2.10 瞬时转染敲除效率 | 第38-39页 |
| 3 讨论 | 第39-41页 |
| 第二章 构建稳转CRISPR/Cas9系统的ST细胞株 | 第41-55页 |
| 1 材料与方法 | 第41-49页 |
| 1.1 实验材料 | 第41页 |
| 1.2 实验方法 | 第41-49页 |
| 1.2.1 Lenti CRISPR V2载体的酶切与回收 | 第41-42页 |
| 1.2.2 sgRNA与酶切后的载体连接 | 第42页 |
| 1.2.3 连接产物的转化 | 第42页 |
| 1.2.4 单一菌落的挑取与测序 | 第42-43页 |
| 1.2.5 阳性克隆的增殖与质粒提取 | 第43页 |
| 1.2.6 慢病毒的包装 | 第43页 |
| 1.2.7 慢病毒侵染ST细胞 | 第43-44页 |
| 1.2.8 用嘌呤霉素(Puromycin)筛选稳转ST细胞 | 第44页 |
| 1.2.9 ST细胞基因组提取 | 第44-45页 |
| 1.2.10 ST细胞基因组PCR及PCR产物测序 | 第45-46页 |
| 1.2.11 Western blot验证稳转ST细胞中Cas9蛋白的表达 | 第46-49页 |
| 2 结果 | 第49-52页 |
| 2.1 Lenti CRISPR V2载体的酶切 | 第49-50页 |
| 2.2 单一菌落测序 | 第50页 |
| 2.3 慢病毒侵染293T细胞 | 第50-51页 |
| 2.4 ST细胞对Puormycin的耐受能力测定 | 第51页 |
| 2.5 ST细胞基因组PCR产物验证 | 第51-52页 |
| 2.6 Western blot | 第52页 |
| 3 讨论 | 第52-55页 |
| 第三章 应用稳转CRISPR/Cas9系统的ST细胞获得突变病毒 | 第55-63页 |
| 1 材料与方法 | 第55-56页 |
| 1.1 实验材料 | 第55页 |
| 1.2 实验方法 | 第55-56页 |
| 1.2.1 病毒侵染稳转ST细胞并收获病毒培养物 | 第55页 |
| 1.2.2 病毒基因组提取及PCR | 第55-56页 |
| 1.2.3 病毒基因组PCR产物凝胶电泳及PCR产物测序 | 第56页 |
| 1.2.4 病毒噬斑纯化及噬斑扩大培养 | 第56页 |
| 1.2.5 纯化后的病毒基因组提取及PCR | 第56页 |
| 1.2.6 纯化后病毒基因组PCR产物凝胶电泳及PCR产物测序 | 第56页 |
| 1.2.7 Western blot做敲除验证 | 第56页 |
| 2 结果 | 第56-62页 |
| 2.1 病毒基因组PCR产物凝胶电泳 | 第56-57页 |
| 2.2 病毒基因组PCR产物测序 | 第57-59页 |
| 2.3 纯化后的病毒基因组PCR产物凝胶电泳 | 第59页 |
| 2.4 纯化后病毒基因组PCR产物测序 | 第59-61页 |
| 2.5 稳转敲除效率 | 第61页 |
| 2.6 Western blot验证病毒相关基因的敲除 | 第61-62页 |
| 3 讨论 | 第62-63页 |
| 第四章 突变型PRV毒力与免疫原性验证 | 第63-79页 |
| 1 材料与方法 | 第63-70页 |
| 1.1 实验材料 | 第63页 |
| 1.2 实验方法 | 第63-70页 |
| 1.2.1 突变病毒的扩大培养及滴度测定 | 第63页 |
| 1.2.2 病毒侵染能力测定 | 第63-64页 |
| 1.2.3 增殖能力测定 | 第64-66页 |
| 1.2.4 小鼠半致死剂量测定 | 第66页 |
| 1.2.5 HE染色 | 第66-67页 |
| 1.2.6 免疫组化 | 第67-69页 |
| 1.2.7 免疫小鼠 | 第69页 |
| 1.2.8 攻毒 | 第69页 |
| 1.2.9 免疫小猪 | 第69页 |
| 1.2.10 抗体检测 | 第69-70页 |
| 2 结果 | 第70-77页 |
| 2.1 PRV gE与TK基因突变后的基因序列 | 第70页 |
| 2.2 PRV及突变型PRV侵染能力 | 第70-71页 |
| 2.3 单一噬斑侵染能力 | 第71-72页 |
| 2.4 野生型PRV及突变型PRV IE180转录水平 | 第72页 |
| 2.5 不同时间段病毒滴度 | 第72-73页 |
| 2.6 PRV及突变型PRV毒力测试 | 第73-74页 |
| 2.7 PRV及突变型PRV LD50测定 | 第74-75页 |
| 2.8 小鼠感染PRV及突变型PRV小脑HE染色 | 第75页 |
| 2.9 小鼠小脑细胞微管形态变化及细胞凋亡情况 | 第75-76页 |
| 2.10 攻毒 | 第76-77页 |
| 2.11 PRV-gB抗体水平 | 第77页 |
| 3 讨论 | 第77-79页 |
| 第五章 突变型HSV1毒力与免疫原性验证 | 第79-87页 |
| 1 材料与方法 | 第79-81页 |
| 1.1 实验材料 | 第79页 |
| 1.2 实验方法 | 第79-81页 |
| 1.2.1 突变病毒的扩大培养及滴度测定 | 第79页 |
| 1.2.2 病毒侵染能力测定 | 第79页 |
| 1.2.3 增殖能力测定 | 第79-80页 |
| 1.2.4 小鼠半致死剂量测定 | 第80页 |
| 1.2.5 HE染色 | 第80页 |
| 1.2.6 免疫组化 | 第80页 |
| 1.2.7 免疫小鼠 | 第80页 |
| 1.2.8 攻毒 | 第80-81页 |
| 2 结果 | 第81-86页 |
| 2.1 野生型HSV1及突变型HSV1侵染能力 | 第81-82页 |
| 2.2 单一噬斑侵染能力 | 第82页 |
| 2.3 病毒增殖能力 | 第82-83页 |
| 2.4 毒力测试 | 第83页 |
| 2.5 小鼠半致死剂量 | 第83-84页 |
| 2.6 小鼠小脑HE染色 | 第84-85页 |
| 2.7 小鼠小脑细胞微管形态变化及细胞凋亡情况 | 第85页 |
| 2.8 攻毒 | 第85-86页 |
| 3 讨论 | 第86-87页 |
| 第六章 结论 | 第87-89页 |
| 参考文献 | 第89-97页 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 | 第97-99页 |
| 致谢 | 第99-101页 |
| 个人简历 | 第101-105页 |
