论文目录 | |
| 摘要 | 第1-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 第一章 引言 | 第12-22页 |
| 1 病原学 | 第12-13页 |
| · 形态及培养 | 第12页 |
| · 理化学特性 | 第12-13页 |
| 2 流行病学 | 第13页 |
| 3 临床症状与病变 | 第13-14页 |
| 4 分子生物学特征 | 第14-16页 |
| · 基因组结构 | 第14页 |
| · TGEV 蛋白的结构与功能 | 第14-16页 |
| · 非结构蛋白 | 第14页 |
| · 结构蛋白 | 第14-16页 |
| 5 诊断 | 第16-18页 |
| · 病毒分离 | 第16-17页 |
| · 病原鉴定 | 第17-18页 |
| · 免疫学鉴定 | 第17页 |
| · 分子生物学鉴定 | 第17-18页 |
| 6 猪传染性胃肠炎疫苗的研究现状 | 第18-20页 |
| · 灭活疫苗 | 第18页 |
| · 弱毒疫苗 | 第18页 |
| · 基因工程疫苗 | 第18-20页 |
| · 重组活载体疫苗 | 第18-19页 |
| · 亚单位疫苗 | 第19-20页 |
| · 核酸疫苗 | 第20页 |
| 7 单克隆抗体的应用与前景 | 第20-21页 |
| · 血清学方面 | 第20-21页 |
| · 免疫学方面 | 第21页 |
| · 抗原纯化方面 | 第21页 |
| 8 小结与展望 | 第21-22页 |
| 第二章 TGEV FJ 株 N 基因的表达及重组 N 蛋白的纯化 | 第22-36页 |
| 1 材料与方法 | 第22-32页 |
| · 材料 | 第22-25页 |
| · 病毒 | 第22页 |
| · 载体与菌株 | 第22-23页 |
| · 主要试剂 | 第23-24页 |
| · 主要溶液及培养基的配制（见附录） | 第24页 |
| · 主要仪器设备 | 第24页 |
| · 引物设计 | 第24-25页 |
| · 方法 | 第25-32页 |
| · PK 细胞的复苏与培养 | 第25页 |
| · 病毒增殖与纯化 | 第25页 |
| · 猪传染性胃肠炎病毒总 RNA 的提取 | 第25-26页 |
| · 猪传染性胃肠炎病毒 N 基因的扩增 | 第26-27页 |
| · 回收目的基因片段与载体连接 | 第27页 |
| · 连接产物的转化 | 第27-28页 |
| · 重组质粒 DNA(pGEM-TGEV-N)的小量提取与鉴定 | 第28-29页 |
| · 重组质粒 PCR 产物回收 | 第29页 |
| · TGEV N 基因在大肠杆菌中的表达 | 第29-31页 |
| · 重组 N 蛋白的 SDS-PAGE 检测 | 第31页 |
| · TGEV 重组 N 蛋白的纯化 | 第31-32页 |
| · 表达产物的免疫印迹（Western blotting）分析 | 第32页 |
| 2 结果 | 第32-35页 |
| · TGEV-N 基因 RT-PCR 扩增结果 | 第32页 |
| · 表达载体 pET-32a(+)-N 的构建和重组质粒 PCR 的鉴定 | 第32-33页 |
| · SDS-PAGE 鉴定结果 | 第33页 |
| · TGEV 重组 N 蛋白的 Western-blotting 检测 | 第33-35页 |
| 3 讨论 | 第35页 |
| · TGEV N 蛋白表达载体的选择 | 第35页 |
| · 融合蛋白免疫原性分析 | 第35页 |
| 4 结论 | 第35-36页 |
| 第三章 TGEV 重组 N 蛋白间接 ELISA 方法的初步建立 | 第36-42页 |
| 1 材料与方法 | 第36-38页 |
| · 材料 | 第36-37页 |
| · 重组 N 蛋白及标准血清 | 第36页 |
| · 待测血清样品 | 第36页 |
| · ELISA 试剂配制（见附录） | 第36页 |
| · 主要试剂 | 第36-37页 |
| · 主要仪器 | 第37页 |
| · 方法 | 第37-38页 |
| · 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法的初步建立 | 第37-38页 |
| 2 结果 | 第38-41页 |
| · ELISA 最佳条件的确定 | 第38-39页 |
| · TGEV-N 蛋白最佳工作浓度和血清稀释度 | 第38页 |
| · 封闭液的确定 | 第38页 |
| · 酶标二抗稀释度的确定 | 第38-39页 |
| · 间接 ELISA 检测方法的建立 | 第39页 |
| · 与 Svanova TGEV/PRCV 试剂盒比较试验 | 第39-41页 |
| 3 讨论 | 第41页 |
| 4 结论 | 第41-42页 |
| 第四章 抗 TGEV-N 蛋白单克隆抗体的制备与特性测定 | 第42-56页 |
| 1 材料与方法 | 第42-48页 |
| · 材料 | 第42-44页 |
| · 病毒株与重组蛋白 | 第42页 |
| · 试验动物与细胞 | 第42-43页 |
| · 试剂 | 第43页 |
| · 抗体与血清 | 第43页 |
| · 主要仪器设备 | 第43-44页 |
| · 方法 | 第44-48页 |
| · 动物免疫 | 第44页 |
| · 病毒培养 | 第44页 |
| · 细胞融合 | 第44-45页 |
| · 阳性杂交瘤细胞培养上清的检测 | 第45页 |
| · 杂交瘤细胞的筛选与克隆 | 第45-46页 |
| · 杂交瘤细胞的复苏与冻存 | 第46页 |
| · 单克隆抗体腹水的制备与采集 | 第46页 |
| · 单克隆抗体的特性鉴定 | 第46-48页 |
| 2 结果 | 第48-53页 |
| · 杂交瘤细胞株的建立 | 第48页 |
| · 杂交瘤细胞染色体分析结果 | 第48-49页 |
| · TGEV-McAb 亚类鉴定 | 第49页 |
| · 单克隆抗体腹水的制备及其效价的测定 | 第49-50页 |
| · 单克隆抗体荧光特性分析 | 第50-51页 |
| · 单抗的特异性鉴定结果 | 第51页 |
| · 单克隆抗体腹水的免疫印迹（Western-blotting）分析 | 第51-53页 |
| 3 讨论与分析 | 第53-55页 |
| · 污染 | 第53页 |
| · 动物免疫 | 第53-54页 |
| · 影响杂交瘤细胞复苏的因素 | 第54页 |
| · 融合后的杂交瘤细胞不生长 | 第54页 |
| · 腹水的采集与处理 | 第54页 |
| · 抗 TGEV-N 蛋白单抗的特性分析 | 第54-55页 |
| 4 结论 | 第55-56页 |
| 第五章 结论 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-63页 |
| 附录 常用试剂配制 | 第63-69页 |
| 1 RPMI-1640 完全培养基 | 第63页 |
| 2 PK 细胞维持液的配制 | 第63页 |
| 3 DMEM 培养液 | 第63页 |
| 4 PK 细胞冻存液的配制 | 第63页 |
| 5 杂交瘤细胞冻存液的配制 | 第63页 |
| 6 HAT 培养基 | 第63-64页 |
| 7 HT 培养基 | 第64页 |
| 8 HANK’S 液的配制 | 第64-65页 |
| 9 双抗贮存液(100×) | 第65页 |
| 10 电泳缓冲液（50×TAE）的配制 | 第65页 |
| 11 LB 培养基 | 第65页 |
| 12 蛋白胶液体配制 | 第65-66页 |
| 13 蛋白纯化液体 | 第66页 |
| 14 WESTERN-BLOTTING 所需主要试剂 | 第66-67页 |
| 15 ELISA 液体配制 | 第67-68页 |
| 16 杂交瘤细胞稳定性检测所用液体 | 第68-69页 |
| 致谢 | 第69页 |
