论文目录 | |
| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-14页 |
| 第一章 绪论 | 第14-24页 |
| 1.1 引言 | 第14-20页 |
| 1.1.1 研究背景及意义 | 第14-15页 |
| 1.1.2 国内外研究进展及成果 | 第15-20页 |
| 1.2 研究目标与主要内容 | 第20-23页 |
| 1.2.1 关键的科学问题与研究目标 | 第20-21页 |
| 1.2.2 主要研究内容 | 第21-22页 |
| 1.2.3 项目来源与经费支持 | 第22-23页 |
| 1.3 研究技术路线图 | 第23-24页 |
| 第二章 白蜡虫far2基因的原核表达 | 第24-41页 |
| 2.1 试验材料与仪器设备 | 第24-26页 |
| 2.1.1 供试菌株及载体质粒 | 第24页 |
| 2.1.2 试验仪器设备 | 第24-25页 |
| 2.1.3 实验器具处理 | 第25页 |
| 2.1.4 工具酶、试剂盒及其他 | 第25-26页 |
| 2.2 试验方法 | 第26-35页 |
| 2.2.1 白蜡虫总RNA提取 | 第26页 |
| 2.2.2 cDNA第一链合成 | 第26-27页 |
| 2.2.3 引物设计 | 第27-28页 |
| 2.2.4 白蜡虫far2基因ORF的克隆 | 第28-29页 |
| 2.2.5 连接与转化 | 第29-30页 |
| 2.2.6 阳性单克隆鉴定 | 第30页 |
| 2.2.7 far2原核表达载体构建 | 第30-32页 |
| 2.2.8连接、转化感受态BL21 | 第32-33页 |
| 2.2.9 IPTG诱导原核表达及诱导条件的优化 | 第33页 |
| 2.2.10 集菌、破碎细胞 | 第33-34页 |
| 2.2.11 Westernblot和SDS-PAGE分析 | 第34-35页 |
| 2.3 试验结果 | 第35-39页 |
| 2.3.1 far2基因的克隆及鉴定 | 第35-36页 |
| 2.3.2 重组载体pET-30a-eGFP/EpelFAR构建成功 | 第36-37页 |
| 2.3.3 SDS-PAGE分析 | 第37-39页 |
| 2.3.4 Westernblot分析 | 第39页 |
| 2.4 讨论 | 第39-40页 |
| 2.5 结论 | 第40-41页 |
| 第三章 白蜡虫FAR2在家蚕细胞中表达 | 第41-56页 |
| 3.1 试验材料与仪器设备 | 第41-42页 |
| 3.1.1 供试BmN家蚕细胞和白蜡虫 | 第41页 |
| 3.1.2 供试菌株及载体质粒 | 第41-42页 |
| 3.1.3 试验仪器设备 | 第42页 |
| 3.1.4 实验器具处理 | 第42页 |
| 3.1.5 工具酶、试剂配制及其他 | 第42页 |
| 3.2 试验方法 | 第42-49页 |
| 3.2.1 白蜡虫far2ORF克隆 | 第42-43页 |
| 3.2.2 连接转化 | 第43页 |
| 3.2.3 阳性克隆鉴定 | 第43页 |
| 3.2.4 感受态DH10B及感受态DH10BacTM细胞的制备 | 第43页 |
| 3.2.5 重组质粒pFast-ie1-FAR2-eGFP的构建 | 第43-45页 |
| 3.2.6 重组Bacmid的获得及PCR鉴定 | 第45-46页 |
| 3.2.7 BmN家蚕细胞的培养和重组病毒Bacmid的感染 | 第46-47页 |
| 3.2.8 eGFP标记FAR2在倒置荧光显微镜下荧光观察 | 第47页 |
| 3.2.9 Westernblot分析 | 第47页 |
| 3.2.10 FAR2蛋白收集 | 第47-49页 |
| 3.3 结果 | 第49-54页 |
| 3.3.1 far2基因的克隆及鉴定 | 第49-50页 |
| 3.3.2 FAR2真核表达载体成功构建 | 第50-51页 |
| 3.3.3 重组病毒Bacmid获得及鉴定 | 第51-52页 |
| 3.3.4 eGFP标记FAR2在倒置荧光显微镜下观察荧光 | 第52-53页 |
| 3.3.5 Westernblot分析和FAR2蛋白成功获得及保存 | 第53-54页 |
| 3.4 讨论 | 第54-55页 |
| 3.5 结论 | 第55-56页 |
| 第四章 白蜡虫FAR2酶活性分析 | 第56-63页 |
| 4.1 试验材料与仪器设备 | 第56页 |
| 4.1.1 试验材料 | 第56页 |
| 4.1.2 仪器设备 | 第56页 |
| 4.2 试验方法 | 第56-57页 |
| 4.2.1 酶反应底物及辅助缓冲液等制备 | 第56-57页 |
| 4.2.2 酶反应体系 | 第57页 |
| 4.2.3 终止酶反应及GC分析 | 第57页 |
| 4.3 GC检测结果 | 第57-61页 |
| 4.4 讨论 | 第61-62页 |
| 4.5 结论 | 第62-63页 |
| 第五章 白蜡虫wsRNAi载体构建及原核表达dsRNA | 第63-73页 |
| 5.1 试验材料与仪器设备 | 第63-64页 |
| 5.1.1 供试昆虫 | 第63页 |
| 5.1.2 供试菌株及载体质粒 | 第63页 |
| 5.1.3 试验仪器设备 | 第63页 |
| 5.1.4 实验器具处理及试剂准备 | 第63-64页 |
| 5.1.5 工具酶、试剂盒及其他 | 第64页 |
| 5.2 试验方法 | 第64-67页 |
| 5.2.1 白蜡虫总RNA提取和引物设计 | 第64页 |
| 5.2.2 cDNA第一链合成 | 第64页 |
| 5.2.3 引物设计 | 第64页 |
| 5.2.4 白蜡虫ws基因片段的克隆 | 第64页 |
| 5.2.5 连接与转化 | 第64-65页 |
| 5.2.6 阳性单克隆鉴定 | 第65页 |
| 5.2.7 双酶切pGEM/EpelWS重组质粒和L4440载体质粒 | 第65页 |
| 5.2.8 连接及转化 | 第65页 |
| 5.2.9 单菌落阳性鉴定 | 第65-66页 |
| 5.2.10 HT115感受态细胞的制备 | 第66页 |
| 5.2.11 白蜡虫wsRNA干扰载体的构建及酶切鉴定 | 第66页 |
| 5.2.12 dsRNA的诱导表达及提取纯化 | 第66-67页 |
| 5.3 试验结果 | 第67-70页 |
| 5.3.1 目的片段的扩增及阳性克隆的筛选 | 第67-68页 |
| 5.3.2 重组载体的构建 | 第68-69页 |
| 5.3.3 原核诱导表达白蜡虫ws基因dsRNA | 第69-70页 |
| 5.3.4 dsRNA的纯化 | 第70页 |
| 5.4 讨论 | 第70-71页 |
| 5.5 结论 | 第71-73页 |
| 第六章 结论与讨论 | 第73-75页 |
| 6.1 结论 | 第73页 |
| 6.2 讨论 | 第73-75页 |
| 参考文献 | 第75-81页 |
| 在读期间的学术研究 | 第81-83页 |
| 附录 A抗生素配制 | 第83-84页 |
| 附录 B分子克隆实验常规试剂配制 | 第84-85页 |
| 附录 CSDS-PAGE相关试剂配制 | 第85-87页 |
| 致谢 | 第87页 |
