论文目录 | |
| 摘要 | 第1-10页 |
| Abstract | 第10-13页 |
| 缩略语表 | 第13-14页 |
| 1 前言 | 第14-23页 |
| 1.1 低氧对鱼类的影响 | 第14页 |
| 1.2 HIF的概况 | 第14-16页 |
| 1.2.1 HIF-1α 的作用机制 | 第15页 |
| 1.2.2 HIF-1α 的功能 | 第15-16页 |
| 1.3 MiRNA的研究进展 | 第16-20页 |
| 1.3.1 MiRNA的发现 | 第16-17页 |
| 1.3.2 MiRNA的生物合成过程 | 第17-18页 |
| 1.3.3 MiRNA的功能 | 第18-19页 |
| 1.3.4 低氧应答相关mi RNA的研究进展 | 第19-20页 |
| 1.4 MiR-125 家族简介 | 第20页 |
| 1.5 Cdc25a的研究进展 | 第20-22页 |
| 1.6 研究目的及意义 | 第22-23页 |
| 2 材料与方法 | 第23-46页 |
| 2.1 实验材料 | 第23-25页 |
| 2.1.1 实验鱼 | 第23页 |
| 2.1.2 实验细胞系 | 第23页 |
| 2.1.3 主要的仪器设备及试剂 | 第23-25页 |
| 2.1.3.1 主要的仪器设备 | 第23-24页 |
| 2.1.3.2 主要的试剂 | 第24-25页 |
| 2.2 实验方法 | 第25-46页 |
| 2.2.1 斑马鱼基因组DNA的提取 | 第25-26页 |
| 2.2.2 总RNA的提取 | 第26页 |
| 2.2.3 反转录 | 第26-27页 |
| 2.2.3.1 通用引物法 | 第26-27页 |
| 2.2.3.2 Stem-loop法 | 第27页 |
| 2.2.4 引物设计 | 第27-29页 |
| 2.2.4.1 MiR-125c反转录引物设计 | 第27页 |
| 2.2.4.2 MiR-125c荧光定量PCR引物设计 | 第27-28页 |
| 2.2.4.3 Cdc25a-3’UTR野生型及突变型扩增引物设计 | 第28-29页 |
| 2.2.5 荧光定量PCR | 第29-30页 |
| 2.2.6 质粒构建 | 第30-33页 |
| 2.2.6.1 包含HRE位点的荧光素酶报告载体的构建 | 第30-31页 |
| 2.2.6.2 用于靶基因验证的质粒构建 | 第31-33页 |
| 2.2.7 细胞实验 | 第33-39页 |
| 2.2.7.1 细胞传代培养 | 第33-34页 |
| 2.2.7.2 细胞冻存以及细胞复苏 | 第34页 |
| 2.2.7.3 HeLa细胞转染及其HRE启动子活性分析 | 第34-36页 |
| 2.2.7.4 HeLa细胞转染及双荧光素酶报告载体活性分析 | 第36页 |
| 2.2.7.5 ZF4细胞转染siRNA | 第36页 |
| 2.2.7.6 CoCl_2模拟低氧处理ZF4细胞 | 第36-37页 |
| 2.2.7.7 细胞增殖检测 | 第37页 |
| 2.2.7.8 细胞周期检测 | 第37-38页 |
| 2.2.7.9 细胞凋亡检测 | 第38-39页 |
| 2.2.8 蛋白实验 | 第39-42页 |
| 2.2.8.1 细胞总蛋白提取 | 第39页 |
| 2.2.8.2 胚胎总蛋白提取 | 第39-40页 |
| 2.2.8.3 Western blot | 第40页 |
| 2.2.8.4 Cdc25a的原核表达及纯化 | 第40-42页 |
| 2.2.9 生物信息学方法预测靶标 | 第42页 |
| 2.2.10 胚胎实验 | 第42-44页 |
| 2.2.10.1 显微注射 | 第42页 |
| 2.2.10.2 Terminal transferase dUTP nick end labeling（TUNEL） | 第42-43页 |
| 2.2.10.3 活胚胎吖啶橙（Acridine orange, AO）染色 | 第43页 |
| 2.2.10.4 斑马鱼机械触动运动轨迹试验 | 第43-44页 |
| 2.2.11 斑马鱼石蜡切片 | 第44-45页 |
| 2.2.11.1 斑马鱼石蜡包埋 | 第44页 |
| 2.2.11.2 切片 | 第44页 |
| 2.2.11.3 H&E染色 | 第44-45页 |
| 2.2.12 数据分析 | 第45-46页 |
| 3 结果与分析 | 第46-60页 |
| 3.1 MiR-125 家族序列分析 | 第46-47页 |
| 3.1.1 MiR-125 家族序列进化树分析 | 第46-47页 |
| 3.1.2 MiR-125 家族的序列特征 | 第47页 |
| 3.2 斑马鱼miR-125c启动子活性分析 | 第47-50页 |
| 3.2.1 斑马鱼ZF4细胞CoCl_2处理 | 第47-48页 |
| 3.2.2 斑马鱼mi R-125c HRE验证 | 第48-49页 |
| 3.2.3 ZF4细胞Hif-1α knockdown | 第49-50页 |
| 3.3 斑马鱼miR-125c靶基因验证 | 第50-51页 |
| 3.4 斑马鱼miR-125c负调控cdc25a的表达 | 第51-54页 |
| 3.4.1 MiR-125c在细胞水平负调控cdc25a的表达 | 第51-53页 |
| 3.4.2 MiR-125c在胚胎中负调控cdc25a的表达 | 第53页 |
| 3.4.3 低氧条件下，mi R-125c与cdc25a的表达相反 | 第53-54页 |
| 3.5 斑马鱼miR-125c对细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响 | 第54-58页 |
| 3.5.1 MiR-125c通过阻滞细胞的G1期进程抑制ZF4细胞增殖 | 第54-56页 |
| 3.5.2 MiR-125c诱导细胞凋亡 | 第56-58页 |
| 3.6 MiR-125c在斑马鱼胚胎发育中的功能 | 第58-60页 |
| 3.6.1 Mi R-125c的过表达影响斑马鱼的胚胎发育 | 第58页 |
| 3.6.2 Mi R-125c的过表达导致斑马鱼仔鱼的运动能力减弱 | 第58-59页 |
| 3.6.3 Mi R-125c过表达引起斑马鱼组织受损 | 第59-60页 |
| 4 讨论 | 第60-64页 |
| 参考文献 | 第64-77页 |
| 附录 | 第77-78页 |
| 致谢 | 第78页 |
