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莲腐败病菌三个PG基因真核表达及功能分析

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莲腐败病菌三个PG基因真核表达及功能分析
论文目录
 
摘要第1-9页
Abstract第9-11页
第一章 前言第11-17页
1 莲腐败病的研究进展第11-12页
  1.1 莲腐败病的发生规律和危害情况第11页
  1.2 莲腐败病的防治第11-12页
    1.2.1 生物防治第11页
    1.2.2 化学防治第11-12页
    1.2.3 轮作第12页
    1.2.4 抗病品种的选育第12页
    1.2.5 冬季莲田浸水第12页
2 多聚半乳糖醛酸酶的研究进展第12-14页
  2.1 多聚半乳糖醛酸酶的类型第12-13页
  2.2 多聚半乳糖醛酸酶基因及其序列特征第13-14页
  2.3 真菌多聚半乳糖醛酸酶的致病性第14页
3 亚细胞定位的研究概况第14-15页
4 本研究的目的及内容第15-16页
  4.1 研究目的第15页
  4.2 研究内容第15-16页
5 技术路线图第16-17页
第二章 莲腐败病菌三个PG同工酶的真核表达第17-35页
1 引言第17页
2 材料和方法第17-18页
  2.1 供试真菌菌株和植物第17页
  2.2 载体及菌株第17页
  2.3 主要试剂第17-18页
  2.4 主要仪器第18页
3 实验方法第18-27页
  3.1 引物设计第18页
  3.2 真核表达构建路线第18-19页
  3.3 pg1、pg5、pgb基因TA克隆第19-20页
    3.3.1 PG基因全长序列的扩增第19页
    3.3.2 PCR产物回收纯化第19页
    3.3.3 连接产物的转化第19-20页
    3.3.4 PCR法鉴定重组子第20页
  3.4 真核表达载体的构建第20-22页
    3.4.1 质粒的提取第20-21页
    3.4.2 TA克隆质粒和载体质粒的双酶切第21页
    3.4.3 酶切产物的纯化回收第21页
    3.4.4 酶切产物的连接第21页
    3.4.5 连接产物的转化第21-22页
    3.4.6 单菌落PCR鉴定阳性克隆第22页
  3.5 PG同工酶重组质粒的真核表达第22-23页
    3.5.1 感受态酵母的制备第22页
    3.5.2 单酶切线性化重组表达质粒的制备第22页
    3.5.3 回收纯化单酶切产物第22页
    3.5.4 电转化感受态Pichia pastoris SMD1168第22-23页
    3.5.5 转化子PCR鉴定第23页
    3.5.6 转化子的诱导表达第23页
  3.6 SDS-PAGE蛋白电泳第23-24页
    3.6.1 制胶第23页
    3.6.2 样品制备第23页
    3.6.3 上样第23页
    3.6.4 电泳第23页
    3.6.5 染色、脱色第23-24页
    3.6.6 检测第24页
  3.7 重组蛋白的Western blot第24页
    3.7.1 SDS-PAGE电泳第24页
    3.7.2 转膜第24页
    3.7.3 染色第24页
    3.7.4 封闭第24页
    3.7.5 抗体孵育第24页
    3.7.6 清洗第24页
    3.7.7 发光液显色第24页
    3.7.8 检测第24页
    3.7.9 保存第24页
  3.8 PG同工酶重组蛋白浓度测定(Bradford法)第24-25页
  3.9 PG同工酶重组蛋白致病性测定第25页
  3.10 PG同工酶重组蛋白的部分酶学特性分析第25-26页
    3.10.1 最适温度的测定第25页
    3.10.2 最适温度稳定性测定第25页
    3.10.3 最适pH的测定第25页
    3.10.4 最适pH稳定性测定第25-26页
  3.11 石蜡切片制作第26-27页
    3.11.1 选材第26页
    3.11.2 杀死、固定第26页
    3.11.3 脱水与透明第26页
    3.11.4 浸蜡第26页
    3.11.5 包埋第26页
    3.11.6 修蜡块第26页
    3.11.7 切片第26页
    3.11.8 展片和粘片第26页
    3.11.9 脱蜡与复水第26页
    3.11.10 染色、透明与封片第26-27页
4 结果分析第27-33页
  4.1 pg1、pg5和pgb基因的TA克隆第27页
  4.2 双酶切第27页
  4.3 真核表达载体pPICZαA-pg1、pPICZαA-pg5和pPICZαA-pgb构建第27-28页
  4.4 pg1、pg5和pgb三个基因的真核表达第28-29页
  4.5 转化子的诱导表达第29页
  4.6 PG1、PG5和PGb同工酶重组蛋白致病性测定第29-31页
  4.7 重组蛋白的部分酶学特性分析第31-33页
  4.8 细胞水平观察第33页
5 结论与讨论第33-35页
第三章 莲腐败病菌三个PG基因产物的亚细胞定位分析第35-42页
1 引言第35页
2 材料和方法第35-38页
  2.1 植物材料第35页
  2.2 菌株和载体第35页
  2.3 试剂和溶液第35页
  2.4 Gateway载体的构建第35-37页
    2.4.1 PCR扩增目的基因第35-36页
    2.4.2 BP反应第36-37页
    2.4.3 LR反应第37页
  2.5 农杆菌转化第37-38页
    2.5.1 农杆菌感受态细胞的制备第37页
    2.5.2 土壤农杆菌转化第37-38页
    2.5.3 转化质粒的培养第38页
  2.6 亚细胞定位第38页
  2.7 信号肽位点分析第38页
3 结果与分析第38-41页
  3.1 信号肽位点分析第38-40页
  3.2 PG1、PG5和PGb在寄主细胞中的亚细胞定位第40-41页
4 结论与讨论第41-42页
第四章 莲腐败病菌PG同工酶的功能验证第42-52页
1 引言第42页
2 材料和方法第42-47页
  2.1 供试菌株及载体第42-43页
  2.2 主要试剂第43页
  2.3 引物设计第43-44页
  2.4 基因敲除载体的构建第44-46页
    2.4.1 扩增PG基因上下游片段第44-45页
    2.4.2 目的片段回收纯化第45页
    2.4.3 单酶切第45页
    2.4.4 连接DNA片段第45页
    2.4.5 反应产物转化、涂板第45页
    2.4.6 克隆鉴定阳性重组子第45-46页
  2.5 镰刀菌转化第46-47页
    2.5.1 镰刀菌F23a孢子的培养第46页
    2.5.2 土壤根瘤农杆菌感受态的制备第46页
    2.5.3 土壤农杆菌转化第46页
    2.5.4 镰刀菌ATMT第46-47页
    2.5.5 PCR检测敲除转化镰刀菌第47页
    2.5.6 突变体菌株的培养第47页
    2.5.7 PG同工酶基因敲除突变体致病性测定第47页
3 结果与分析第47-50页
  3.1 PG同工酶基因敲除载体的构建第47-48页
  3.2 镰刀菌ATMT第48页
  3.3 野生型F23a与敲除突变体△F23a进行比较分析第48-49页
  3.4 突变体F23a致病性分析第49-50页
4 结论与讨论第50-52页
参考文献第52-56页
附录第56-62页
致谢第62页

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