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水稻CRISPR基因组编辑系统的拓展及优化

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水稻CRISPR基因组编辑系统的拓展及优化
论文目录
 
摘要第1-7页
abstract第7-12页
第一章 前言第12-21页
  1.1 常规基因组编辑手段第12-13页
    1.1.1 锌指核酸酶(ZFN)第12页
    1.1.2 转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)第12页
    1.1.3 规律成簇的间隔短回文重复编辑/效应蛋白(CRISPR系统)第12-13页
  1.2 CRISPR-Cas9系统第13-19页
    1.2.1 CRISPR-Cas9原理第13-17页
    1.2.2 水稻CRISPR-Cas9编辑系统第17-18页
    1.2.3 Cas9变体蛋白VQR及VRER第18-19页
  1.3 CRISPR-Cpf1系统第19-20页
    1.3.1 CRISPR-Cpf1原理第19-20页
    1.3.2 人类CRISPR-Cpf1编辑系统第20页
  1.4 本课题研究思路第20-21页
第二章 拓展水稻基因组编辑范围的研究第21-87页
  2.1 实验材料与方法第21-42页
    2.1.1 敲除基因及靶位点选择第21-24页
    2.1.2 Cas9及Cpf1表达序列优化第24页
    2.1.3 Cas9变体蛋白创制第24-27页
      2.1.3.1 VQR的创制第24-25页
      2.1.3.2 VRER的创制第25-27页
    2.1.4 sgRNA改进第27-28页
    2.1.5 CRISPR系统基因敲除载体构建第28-34页
      2.1.5.1 CRISPR-Cas9第28-32页
      2.1.5.2 CRISPR-Cpf1第32-34页
    2.1.6 感受态制备及转化第34-35页
      2.1.6.1 大肠杆菌DH5α第34-35页
      2.1.6.2 农杆菌EHA105第35页
    2.1.7 水稻原生质体细胞转化第35-36页
    2.1.8 农杆菌介导的水稻转基因第36-37页
    2.1.9 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取水稻DNA第37页
    2.1.10 靶位点突变检测及分析第37-40页
      2.1.10.1 酶切法第37-38页
      2.1.10.2 Sanger测序第38-39页
      2.1.10.3 高通量测序第39-40页
    2.1.11 水稻基因组潜在靶位点数目分析第40页
    2.1.12 脱靶效应评估第40-42页
  2.2 结果与分析第42-84页
    2.2.1 水稻CRISPR-VQR/VRER编辑体系的建立第42-52页
      2.2.1.1 VQR成功编辑水稻基因第42-46页
      2.2.1.2 脱靶位点检测第46-47页
      2.2.1.3 VQR对NGA PAM的偏好性分析第47-48页
      2.2.1.4 VRER成功造成水稻基因突变第48-52页
      2.2.1.5 水稻基因组潜在可编辑位点分析第52页
    2.2.2 CRISPR-Cas9/VQR编辑系统优化第52-60页
      2.2.2.1 改进sgRNA第52-53页
      2.2.2.2 改进后的sgRNA提高CRISPR-Cas9/VQR系统突变效率第53-57页
      2.2.2.3 水稻Ubi及Actin启动子提高CRISPR-VQR编辑系统效率第57-59页
      2.2.2.4 优化CRISPR-VQR编辑系统脱靶效应检测第59-60页
    2.2.3 野生型Cas9在水稻中高效识别NAG PAM第60-73页
      2.2.3.1 Cas9意外产生NAG PAM靶位点突变第60-61页
      2.2.3.2 Cas9在水稻中高效识别NAG PAM第61-63页
      2.2.3.3 NAG PAM具有更低的错配容忍度第63-66页
      2.2.3.4 Cas9在原生质体中对NAG PAM的编辑能力有限第66-68页
      2.2.3.5 CRISPR-Cas9体系在转基因水稻中高效编辑NAG PAM位点第68-71页
      2.2.3.6 PAM周遭序列对NAG PAM识别的影响第71页
      2.2.3.7 NGG和NAG PAM混合敲除模式第71-72页
      2.2.3.8 NAG PAM潜在可编辑位点分析第72-73页
    2.2.4 水稻CRISPR-Cpf1编辑体系的建立第73-78页
      2.2.4.1 tRNA间隔构建Cpf1多基因敲除系统第73-74页
      2.2.4.2 CRISPR-Cpf1成功编辑水稻基因组第74-76页
      2.2.4.3 crRNA3’端附加序列对基因编辑的影响第76-77页
      2.2.4.4 DNA突变类型及脱靶效应分析第77-78页
    2.2.5 CRISPR-Cpf1多基因编辑系统条件探索第78-84页
      2.2.5.1 TIP法构建Cpf1串联crRNA表达阵列第78-80页
      2.2.5.2 改进tRNA-crRNA系统在低效位点表现优于串联系统第80-82页
      2.2.5.3 串联系统在高效位点与改进tRNA-crRNA系统表现一致第82-83页
      2.2.5.4 全长DR序列与延长spacer序列对效率影响有限第83-84页
  2.3 讨论第84-87页
第三章 研究展望与创新点第87-88页
  3.1 研究展望第87页
  3.2 本课题的创新点第87-88页
参考文献第88-93页
附录第93-110页
致谢第110-112页
作者简历第112页

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