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小鼠Resistin的克隆、原核表达、纯化及其调控小鼠骨髓造血的实验研究

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小鼠Resistin的克隆、原核表达、纯化及其调控小鼠骨髓造血的实验研究
论文目录
 
摘要第1-8页
ABSTRACT第8-17页
第一章 绪论第17-21页
第二章 材料第21-31页
  2.1 实验仪器与设备第21-22页
  2.2 主要试剂与配制第22-31页
    2.2.1 常规试剂第22-24页
    2.2.2 质粒与菌株第24页
    2.2.3 细菌培养基第24页
    2.2.4 蛋白电泳缓冲系统第24页
    2.2.5 重组蛋白分离纯化溶液第24-25页
    2.2.6 质粒提取溶液配制第25页
    2.2.7 Western blot 相关试剂的配制第25-26页
    2.2.8 内毒素测定相关溶液及试剂第26页
    2.2.9 动物实验相关材料第26-27页
    2.2.10 流式细胞仪检测细胞周期相关试剂和材料第27页
    2.2.11 造血祖细胞集落培养相关试剂和溶液配制第27-31页
第三章 方法第31-64页
  3.1 真核表达重组质粒phCMV1-mResistin 的制备第31-43页
    3.1.1 PCR 引物设计第31-32页
    3.1.2 RT-PCR 扩增mResistin 片段第32-34页
    3.1.3 DNA 琼脂糖凝胶电泳第34-35页
    3.1.4 PCR 产物割胶回收第35页
    3.1.5 phCMV1 质粒抽提(碱裂解法)第35-36页
    3.1.6 酶切反应第36页
    3.1.7 连接反应第36-37页
    3.1.8 感受态细胞制备(CaC12法)第37页
    3.1.9 连接产物的转化反应第37-38页
    3.1.10 PCR 检测目的基因及测序第38页
    3.1.11 PCR 纠正突变第38-40页
    3.1.12 质粒大量抽提第40-42页
    3.1.13 抽提质粒内毒素第42页
    3.1.14 分光光度计测双链DNA 的浓度第42-43页
  3.2 mResistin 的蛋白表达、纯化与生物活性分析第43-58页
    3.2.1 PCR 引物设计第43-44页
    3.2.2 PCR 扩增mResistin 成熟肽序列第44-45页
    3.2.3 电泳估计浓度第45页
    3.2.4 mResistin 片段酶切反应第45-46页
    3.2.5 载体pET28a 准备第46-47页
    3.2.6 连接反应第47页
    3.2.7 连接产物的转化反应第47-48页
    3.2.8 双酶切检测目的基因及测序第48页
    3.2.9 mResistin 诱导表达条件优化第48-49页
    3.2.10 mResistin 的诱导表达第49页
    3.2.11 包涵体的分离和洗涤第49-50页
    3.2.12 包涵体的变性和复性第50-51页
    3.2.13 Sp-Sephorose 阳离子交换层析第51页
    3.2.14 Bradford 法测定蛋白溶液浓度第51-52页
    3.2.15 蛋白样品SDS-PAGE第52-53页
    3.2.16 Western blot 检测阳离子交换柱纯化后蛋白的抗原性第53-55页
    3.2.17 mResistin 重组蛋白生物学活性测定第55-57页
    3.2.18 显色基质法测定蛋白内毒素含量第57-58页
  3.3 动物实验第58-64页
    3.3.1 小鼠骨髓细胞的获取第58-59页
    3.3.2 小鼠骨髓细胞总RNA 的抽提第59页
    3.3.3 RNA 溶液质量的检测第59-60页
    3.3.4 phCMV1-mRETN 质粒注射正常小鼠第60页
    3.3.2 外周血检测第60-61页
    3.3.3 骨髓细胞采集及计数第61-62页
    3.3.4 流式细胞仪检测骨髓单个核细胞周期第62页
    3.3.5 重组蛋白rmResistin 注射正常小鼠第62-63页
    3.3.6 高剂量5-Fu 作用下rmResistin 对小鼠存活率的影响第63-64页
第四章 结果第64-81页
  4.1 mResistin 的基因克隆及蛋白表达纯化结果第64-77页
    4.1.1 总RNA 的提取结果第64页
    4.1.2 总RNA 的吸光度测定第64-65页
    4.1.3 RT-PCR 扩增mResistin CDS 序列结果第65页
    4.1.4 mResistin-phCMV1 PCR 鉴定及测序结果第65-66页
    4.1.5 PCR 纠正突变第66-67页
    4.1.6 mResistin-phCMV1 酶切鉴定及测序结果第67-68页
    4.1.7 PCR 扩增mResistin 成熟肽序列结果第68-69页
    4.1.8 pET28a(+)-mResistin 酶切鉴定及测序结果第69-70页
    4.1.9 mResistin 诱导条件的优化第70页
    4.1.10 mResistin 重组菌诱导表达后包涵体的准备第70-71页
    4.1.11 包涵体的溶解及蛋白变性复性结果第71-73页
    4.1.12 mResistin 过Sp-Sepharose 柱纯化结果第73页
    4.1.13 重组mResistin 蛋白SDS-PAGE 电泳鉴定第73-74页
    4.1.14 Bradford 法测定重组蛋白浓度第74-75页
    4.1.15 Western blot 检测蛋白抗原性第75-76页
    4.1.16 重组蛋白rmResistin 活性测定第76页
    4.1.17 重组蛋白内毒素含量测定第76-77页
  4.2 动物实验结果第77-81页
    4.2.1 重组质粒phCMV1-mResistin 注射正常小鼠结果第77-78页
    4.2.2 重组mResistin 蛋白注射正常小鼠结果第78-79页
    4.2.3 高剂量5-Fu 作用下rmResistin 对小鼠存活率的影响结果第79-81页
第五章 讨论第81-84页
参考文献第84-87页
文献综述第87-92页
参考文献第92-95页
致谢第95-96页
硕士期间发表的论著第96页

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