论文目录 | |
致谢 | 第1-6页 |
摘要 | 第6-7页 |
Abstract | 第7-8页 |
目次 | 第9-12页 |
1 前言 | 第12-27页 |
1.1 多胺的简介及研究进展 | 第12-15页 |
1.1.1 什么是多胺 | 第12页 |
1.1.2 多胺的功能 | 第12-13页 |
1.1.3 多胺的代谢 | 第13-15页 |
1.1.4 多胺代谢与肿瘤治疗 | 第15页 |
1.2 鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase,ODC) | 第15-18页 |
1.2.1 ODC的基本表述 | 第15-16页 |
1.2.2 ODC的结构研究 | 第16-18页 |
1.3 抗酶蛋白(antizyme,OAZ) | 第18-23页 |
1.3.1 OAZ的基本表述 | 第18-19页 |
1.3.2 OAZ的种类 | 第19-20页 |
1.3.3 OAZ的核糖体移码现象 | 第20-21页 |
1.3.4 OAZ的功能 | 第21-22页 |
1.3.5 OAZ的研究进展 | 第22-23页 |
1.3.6 OAZ的结构研究 | 第23页 |
1.4 鸟氨酸脱羧酶抗酶蛋白抑制因子(antizyme inhibitor,OAZI) | 第23-24页 |
1.5 多胺在体内代谢 | 第24页 |
1.6 此项研究的意义 | 第24-27页 |
2 材料 | 第27-33页 |
2.1 菌株和质粒 | 第27页 |
2.2 主要化学和生物试剂 | 第27页 |
2.3 主要仪器 | 第27-29页 |
2.4 蛋白纯化试剂柱 | 第29页 |
2.5 实验试剂的配制 | 第29-33页 |
3 实验方法 | 第33-47页 |
3.1 克隆、表达 | 第33-40页 |
3.1.1 引物设计 | 第33-34页 |
3.1.2 ODC基因扩增 | 第34-35页 |
3.1.3 PCR产物纯化 | 第35页 |
3.1.4 酶切目的片段 | 第35页 |
3.1.5 连接反应 | 第35-36页 |
3.1.6 大肠杆菌感受态细胞制备 | 第36页 |
3.1.7 大肠杆菌感受态细胞转化 | 第36-37页 |
3.1.8 菌落PCR | 第37页 |
3.1.9 挑选菌株,进行扩大培养 | 第37页 |
3.1.10 提取质粒pGEX-6p-1-ODC | 第37-38页 |
3.1.11 酶切鉴定 | 第38-39页 |
3.1.12 测序 | 第39页 |
3.1.13 转化到表达菌E.coli BL21 | 第39页 |
3.1.14 菌落PCR及扩大培养 | 第39页 |
3.1.15 小量表达 | 第39页 |
3.1.16 大量诱导表达 | 第39-40页 |
3.1.17 SDS-PAGE | 第40页 |
3.1.18 AZ1基因扩增 | 第40页 |
3.2 纯化 | 第40-44页 |
3.2.1 从细胞中得到较纯的融化蛋白 | 第40-42页 |
3.2.1.1 纯化柱预处理 | 第41页 |
3.2.1.2 菌液准备 | 第41页 |
3.2.1.3 融合蛋白纯化 | 第41-42页 |
3.2.1.4 GST纯化beads的再生 | 第42页 |
3.2.1.5 加入PreScission蛋白酶酶切去除GST标签 | 第42页 |
3.2.2 去除GST标签,得到较纯目的蛋白 | 第42-44页 |
3.2.2.1 蛋白质脱盐 | 第42-43页 |
3.2.2.2 Second GST,去除GST标签 | 第43页 |
3.2.2.3 过离子交换试验,得到较纯目的蛋白 | 第43-44页 |
3.2.3 分子筛层析,得到纯度达95%的目的蛋白 | 第44页 |
3.3 结晶 | 第44-46页 |
3.3.1 寻找合适的蛋白质结晶浓度 | 第45页 |
3.3.2 结晶条件的初步筛选 | 第45页 |
3.3.3 结晶条件的优化 | 第45-46页 |
3.4 X射线衍射数据的收集 | 第46-47页 |
3.4.1 选择合适的保护剂 | 第46页 |
3.4.2 数据收集及处理 | 第46-47页 |
4 实验结果与分析 | 第47-67页 |
4.1 酵母鸟氨酸脱羧酶SPE和抗酶蛋白AZ的融合蛋白的实验研究 | 第47-53页 |
4.1.1 SPE和AZ目的基因的克隆 | 第47-48页 |
4.1.2 SPE和AZ蛋白的诱导表达 | 第48-49页 |
4.1.3 SPE和AZ蛋白的纯化 | 第49-53页 |
4.2 人类鸟氨酸脱羧酶ODC和抗酶蛋白OAZ的融合蛋白实验研究 | 第53-61页 |
4.2.1 ODC和OAZ目的基因的克隆及诱导表达 | 第53-54页 |
4.2.2 ODC和OAZ蛋白的纯化 | 第54-59页 |
4.2.3 ODC和OAZ蛋白的晶体分析 | 第59页 |
4.2.3.1 质谱鉴定 | 第59页 |
4.2.3.2 蛋白浓度测定 | 第59页 |
4.2.3.3 大规模筛选分析 | 第59-60页 |
4.2.3.4 晶体生长条件优化 | 第60-61页 |
4.3 人类鸟氨酸脱羧酶ODC和抗酶蛋白OAZ1-ORF2的融合蛋白研究 | 第61-67页 |
4.3.1 ODC和OAZ1-ORF2目的基因的克隆及诱导表达 | 第61-62页 |
4.3.2 ODC和OAZ1-ORF2蛋白的纯化 | 第62-63页 |
4.3.3 人类ODC和抗酶蛋白OAZ1-ORF2的融合蛋白结晶分析 | 第63-66页 |
4.3.3.1 ODC和OAZ1-ORF2的融合蛋白质谱鉴定 | 第63-64页 |
4.3.3.2 ODC和OAZ1-ORF2的融合蛋白蛋白浓度测定 | 第64页 |
4.3.3.3 ODC和OAZ1-ORF2的融合蛋白大规模筛选分析 | 第61-66页 |
4.3.4 ODC和OAZ1-ORF2的融合蛋白数据的收集 | 第66-67页 |
5. 讨论与展望 | 第67-69页 |
5.1 结果总结分析 | 第67页 |
5.2 展望 | 第67-69页 |
参考文献 | 第69-74页 |
作者简介和科研成果 | 第74页 |