论文目录 | |
| 摘要 | 第1-8页 |
| ABSTRACT | 第8-9页 |
| 第一部分 文献综述 | 第9-22页 |
| 1 锌指蛋白的来源及种类 | 第9-15页 |
| · C_2H_2锌指蛋白的结构特征 | 第9-10页 |
| · Zn~(2+)对锌指蛋白构象的影响 | 第10-11页 |
| · REST/NRSF蛋白的发现、特征及功能 | 第11-14页 |
| · REST/NRSF调控基因转录的途径 | 第14-15页 |
| 2 CoREST蛋白 | 第15-18页 |
| · CoREST蛋白的结构特征 | 第15页 |
| · CoREST蛋白的生物学功能 | 第15-16页 |
| · CoREST抑制基因转录的作用机制 | 第16-17页 |
| · CoREST相互作用的生理学意义 | 第17-18页 |
| 3 RNA沉默现象 | 第18-19页 |
| 4 NRSE dsRNA与REST/NRSF的相互作用 | 第19-21页 |
| 5 本课题的研究思路、目的与意义 | 第21-22页 |
| 第二部分 材料和方法 | 第22-29页 |
| 1 材料 | 第22-26页 |
| · 仪器 | 第22-23页 |
| · 培养基 | 第23-24页 |
| · 缓冲液 | 第24-25页 |
| · 试剂 | 第25页 |
| · 菌株及质粒 | 第25-26页 |
| · 其它试剂 | 第26页 |
| 2 方法 | 第26-29页 |
| · 感受态细胞的制备 | 第26页 |
| · 转化 | 第26-27页 |
| · PCR反应体系 | 第27页 |
| · 质粒的制备 | 第27页 |
| · 连接 | 第27页 |
| · 重组质粒的小量表达 | 第27-28页 |
| · Ni~(2+)柱的再生 | 第28页 |
| · 表达和纯化 | 第28-29页 |
| 第三部分 CoREST蛋白SANT1结构域质粒构建、表达纯化 | 第29-48页 |
| 1 含His·tag的pSJ3-CoREST SANT1的质粒构建 | 第29-30页 |
| · 引物设计 | 第29页 |
| · PCR扩增 | 第29-30页 |
| · 重组质粒的菌液PCR鉴定 | 第30页 |
| · 分析 | 第30页 |
| 2 重组pSJ3-CoREST SANT1表达条件的优化 | 第30-34页 |
| 2.1 重组质粒pSJ3 SANT1小量表达条件的优化 | 第30-33页 |
| · 分析 | 第33-34页 |
| 3 含SUMO-tag和FLAG-tag的pSMT3-CoREST-FLAG SANT1的质粒构建 | 第34-35页 |
| · 引物设计 | 第34页 |
| · PCR扩增 | 第34-35页 |
| · 重组质粒的菌液PCR鉴定 | 第35页 |
| · 分析 | 第35页 |
| 4 含SUMO·tag和FLAG·tag的pSMT3-CoREST-FLAG SANT1蛋白表达条件的优化 | 第35-38页 |
| · 重组质粒pSMT3-SANT1-FLAG小量表达的优化 | 第35-38页 |
| · 分析 | 第38页 |
| 5 含GB1·tag的pHGB-CoREST SANT1的质粒构建 | 第38-40页 |
| · 引物设计 | 第38-39页 |
| · PCR扩增 | 第39页 |
| · 目标质粒的菌液PCR鉴定 | 第39-40页 |
| · 分析 | 第40页 |
| 6 GB1·tag CoREST SANT1融合蛋白表达条件的优化 | 第40-43页 |
| 6.1 重组质粒pHGB SANT1小量表达条件的优化 | 第40-43页 |
| · 分析 | 第43页 |
| 7 pHGB CoREST SANT1大量表达和纯化 | 第43-47页 |
| · 表达和纯化 | 第43-44页 |
| · 离子交换柱纯化 | 第44-45页 |
| · 第二次纯化后的SDS-PAGE检测 | 第45页 |
| · 分析和讨论 | 第45-47页 |
| 8 本章小结 | 第47-48页 |
| 第四部分 CoREST蛋白SANT2结构域的表达与纯化 | 第48-65页 |
| 1 pET28a CoREST SANT2在M9中表达条件优化 | 第48-51页 |
| 1.1 重组质粒pET28a SANT2小量表达条件的优化 | 第48-51页 |
| · 分析 | 第51页 |
| 2 ~(15)N标记CoREST SANT2大量表达和纯化 | 第51-54页 |
| · 表达和纯化 | 第51-52页 |
| · SDS-PAGE检测 | 第52-53页 |
| · 透析和酶切 | 第53页 |
| · 第二次Ni柱纯化 | 第53-54页 |
| · 分析 | 第54页 |
| 3 ~(15)N标记的CoREST SANT2蛋白NMR样品的制备 | 第54-56页 |
| · 自由态SANT2样品 | 第54-55页 |
| · SANT2与ZF9复合物样品的制备 | 第55页 |
| 3.3 SANT2与核酸(NRSE/RE1 dsDNA和dsRNA)复合物样品制备 | 第55-56页 |
| 4 二维1H-15N HSQC结果与分析 | 第56-62页 |
| · 结果 | 第56-61页 |
| · 分析与讨论 | 第61-62页 |
| 5 CD光谱研究Zn~(2+)对SANT2构象的影响 | 第62-64页 |
| · 结果 | 第62-63页 |
| · 分析与讨论 | 第63-64页 |
| 6 本章小结 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-72页 |
| 致谢 | 第72-73页 |
| 附录 | 第73-79页 |
| 附录1 | 第73-74页 |
| 附录2 | 第74-75页 |
| 附录3 | 第75-76页 |
| 附录4 | 第76-77页 |
| 附录5 | 第77-78页 |
| 附录6 | 第78-79页 |
| 附录7 | 第79
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