论文目录 | |
| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-16页 |
| 缩略词 | 第16-17页 |
| 第一章 绪论 | 第17-35页 |
| 1.1 海藻酸及海藻酸寡糖的应用前景 | 第17-24页 |
| 1.1.1 海藻酸的来源及结构 | 第17-18页 |
| 1.1.2 海藻酸的理化性质 | 第18-19页 |
| 1.1.3 海藻酸寡糖的制备方法 | 第19-20页 |
| 1.1.4 海藻酸及其寡糖的生物学功能 | 第20-24页 |
| 1.1.4.1 日化领域 | 第20-21页 |
| 1.1.4.2 食品领域 | 第21页 |
| 1.1.4.3 医药领域 | 第21-23页 |
| 1.1.4.4 能源领域 | 第23-24页 |
| 1.1.4.5 其他领域 | 第24页 |
| 1.2 海藻酸裂解酶及其研究现状 | 第24-28页 |
| 1.2.1 海藻酸裂解酶的来源和分类 | 第24-26页 |
| 1.2.2 海藻酸裂解酶的结构和作用机理 | 第26-27页 |
| 1.2.3 海藻酸裂解酶的功能和应用前景 | 第27-28页 |
| 1.3 海藻酸降解机理的研究现状及存在问题 | 第28-29页 |
| 1.4 海藻酸代谢工程菌构建的研究现状及存在问题 | 第29-31页 |
| 1.5 研究意义及研究内容 | 第31-35页 |
| 1.5.1 研究意义 | 第31-32页 |
| 1.5.2 研究内容 | 第32-35页 |
| 第二章 海藻酸裂解酶的克隆表达及酶学性质研究 | 第35-83页 |
| 2.1 实验材料 | 第35-39页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第35-36页 |
| 2.1.2 所用主要试剂及其配制 | 第36-37页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第37-38页 |
| 2.1.4 培养基配方 | 第38-39页 |
| 2.2 实验方法 | 第39-53页 |
| 2.2.1 聚古罗糖醛酸和聚甘露糖醛酸的制备 | 第39-40页 |
| 2.2.2 引物设计与合成 | 第40-41页 |
| 2.2.3 Sunxiuqinia sp. SH-52的基因组提取 | 第41-42页 |
| 2.2.4 海藻酸裂解酶基因的PCR扩增 | 第42-43页 |
| 2.2.5 琼脂糖电泳检测及目的片段回收纯化 | 第43-45页 |
| 2.2.6 质粒的提取 | 第45-46页 |
| 2.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第46-47页 |
| 2.2.8 PCR产物的TA克隆 | 第47-48页 |
| 2.2.8.1 PCR产物A尾连接 | 第47页 |
| 2.2.8.2 TA克隆 | 第47-48页 |
| 2.2.8.3 海藻酸裂解酶的系统进化分析 | 第48页 |
| 2.2.9 目的基因与表达载体的连接 | 第48-49页 |
| 2.2.10 目的蛋白的表达与纯化 | 第49-51页 |
| 2.2.10.1 目的蛋白重组菌的构建表达 | 第49页 |
| 2.2.10.2 蛋白含量的测定 | 第49-50页 |
| 2.2.10.3 SDS-PAGE操作步骤 | 第50页 |
| 2.2.10.4 蛋白诱导表达条件优化 | 第50-51页 |
| 2.2.10.5 蛋白纯化步骤 | 第51页 |
| 2.2.11 酶活测定及酶学特性分析 | 第51-53页 |
| 2.2.12 TLC分析 | 第53页 |
| 2.3 实验结果 | 第53-77页 |
| 2.3.1 聚甘露糖醛酸PolyM和聚古罗糖醛酸PolyG的制备 | 第53-54页 |
| 2.3.2 Sunxiuqinia sp. SH-52海藻酸裂解酶SH4-2、SHA-3、SHA-4和SHA-5的原核表达及酶特性分析 | 第54-77页 |
| 2.3.2.1 TA克隆载体的构建策略 | 第54-56页 |
| 2.3.2.2 TA克隆载体的构建 | 第56-60页 |
| 2.3.2.3 Sunxiuqinia sp. SH-52海藻酸裂解酶的系统进化分析 | 第60-63页 |
| 2.3.2.4 表达载体的构建策略 | 第63-66页 |
| 2.3.2.5 表达载体的构建 | 第66-68页 |
| 2.3.2.6 重组酶的诱导表达 | 第68-70页 |
| 2.3.2.7 重组酶的酶学性质研究 | 第70-76页 |
| 2.3.2.8 重组酶对海藻酸的降解研究 | 第76-77页 |
| 2.4 小结 | 第77页 |
| 2.5 讨论 | 第77-83页 |
| 2.5.1 海藻酸裂解酶的重组表达 | 第77-78页 |
| 2.5.2 海藻酸裂解酶的纯化 | 第78-80页 |
| 2.5.3 海藻酸裂解酶的酶学性质 | 第80-83页 |
| 第三章 海藻酸降解机理的研究 | 第83-97页 |
| 3.1 实验材料 | 第84页 |
| 3.1.1 供试菌株 | 第84页 |
| 3.1.2 主要试剂及配制 | 第84页 |
| 3.1.3 主要仪器 | 第84页 |
| 3.1.4 主要培养基 | 第84页 |
| 3.2 实验方法 | 第84-86页 |
| 3.2.1 海藻酸裂解酶的纯化 | 第84-85页 |
| 3.2.2 PolyG和PolyM的制备 | 第85页 |
| 3.2.3 海藻酸裂解酶活性的测定 | 第85页 |
| 3.2.4 海藻酸裂解酶的性质 | 第85页 |
| 3.2.5 海藻酸裂解酶不同比例混合的酶活测定 | 第85-86页 |
| 3.2.6 协同度(DS)的计算 | 第86页 |
| 3.3 实验结果 | 第86-94页 |
| 3.3.1 重组酶的表达纯化 | 第86-90页 |
| 3.3.1.1 重组海藻酸裂解酶的纯化 | 第86-88页 |
| 3.3.1.2 重组海藻酸裂解酶的特性 | 第88-90页 |
| 3.3.2 来自Sphingomonas sp. ZH0的重组酶的协同作用研究 | 第90-92页 |
| 3.3.3 来自Sunxiuqinia sp. SH-52的重组酶的协同作用研究 | 第92-94页 |
| 3.4 小结 | 第94-95页 |
| 3.5 讨论 | 第95-97页 |
| 第四章 海藻酸代谢途径关键酶的重组表达 | 第97-119页 |
| 4.1 实验材料 | 第98-100页 |
| 4.1.1 菌株和质粒 | 第98页 |
| 4.1.2 主要试剂及其配制 | 第98-99页 |
| 4.1.3 主要仪器 | 第99-100页 |
| 4.1.4 主要培养基 | 第100页 |
| 4.2 实验方法 | 第100-104页 |
| 4.2.1 引物设计与合成 | 第100页 |
| 4.2.2 Sunxiuqinia sp. SH-52的基因组提取 | 第100-101页 |
| 4.2.3 PCR扩增 | 第101页 |
| 4.2.4 DNA检测回收及质粒提取 | 第101页 |
| 4.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第101页 |
| 4.2.6 TA克隆 | 第101页 |
| 4.2.7 代谢关键酶基因dehR和kdgK的系统进化分析 | 第101-102页 |
| 4.2.8 目的基因与表达载体的连接 | 第102页 |
| 4.2.9 目的蛋白重组菌的构建表达及纯化 | 第102-103页 |
| 4.2.10 海藻酸单体DEH的制备 | 第103页 |
| 4.2.11 目的蛋白的活性测定 | 第103-104页 |
| 4.2.12 重组质粒pGEX-4T-1-dehR-kdgK的构建 | 第104页 |
| 4.3 实验结果 | 第104-116页 |
| 4.3.1 TA克隆载体pMD19T-dehR和pMD19T-kdgK的构建 | 第104-106页 |
| 4.3.2 海藻酸代谢关键酶dehR和kdgK的进化分析 | 第106-107页 |
| 4.3.3 原核表达载体pGEX-4T-1-dehR和pGEX-4T-1-kdgK的构建 | 第107-108页 |
| 4.3.4 重组酶dehR和kdgK的诱导表达 | 第108-111页 |
| 4.3.5 海藻酸单体DEH的制备 | 第111-113页 |
| 4.3.6 重组酶dehR和kdgK的活性测定 | 第113-114页 |
| 4.3.7 重组质粒PGEX-4T-1-dehR-kdgK的构建 | 第114-116页 |
| 4.4 小结 | 第116页 |
| 4.5 讨论 | 第116-119页 |
| 第五章 结论与展望 | 第119-123页 |
| 5.1 结论 | 第119-121页 |
| 5.3 展望 | 第121-123页 |
| 致谢 | 第123-125页 |
| 参考文献 | 第125-137页 |
| 附录 攻读硕士期间发表的论文和专利 | 第137页 |
