论文目录 | |
| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-10页 |
| 第1章 绪论 | 第10-24页 |
| 1.1 序言 | 第10-12页 |
| 1.2 冷冻电镜三维重构技术 | 第12-15页 |
| 1.2.1 电镜三维重构的原理介绍 | 第12-13页 |
| 1.2.2 单颗粒冷冻电镜设备的发展 | 第13-14页 |
| 1.2.3 单颗粒冷冻电镜三维重构软件的介绍-EMAN | 第14页 |
| 1.2.4 高性能计算在冷冻电镜数据处理中的应用 | 第14-15页 |
| 1.3 RNA聚合酶Ⅱ参与的转录延伸过程的基本介绍 | 第15-16页 |
| 1.4 Set2的存在状态与功能的研究 | 第16-17页 |
| 1.5 CDK激酶的研究 | 第17-19页 |
| 1.5.1 Ctk1复合物的组成与功能 | 第18-19页 |
| 1.5.2 Bur1复合物的组成与功能 | 第19页 |
| 1.6 Spt5的结构与功能的研究 | 第19-22页 |
| 1.6.1 Spt5复合物的发现与结构特点 | 第20-21页 |
| 1.6.2 Spt5复合物的功能 | 第21-22页 |
| 1.7 本课题的研究内容与意义 | 第22-24页 |
| 第2章 实验材料与实验方法 | 第24-44页 |
| 2.1 实验材料 | 第24页 |
| 2.2 原核重组蛋白GST-CTD-6His的载体构建 | 第24页 |
| 2.3 GST-CTD-6His蛋白的重组表达与纯化 | 第24-26页 |
| 2.4 酵母克隆的构建及检测 | 第26-29页 |
| 2.4.1 引物合成 | 第26-27页 |
| 2.4.2 PCR扩增用于同源重组的片段 | 第27-28页 |
| 2.4.3 制备酵母感受态细胞 | 第28页 |
| 2.4.4 酵母感受态细胞的转化 | 第28-29页 |
| 2.4.5 酵母阳性克隆的鉴定 | 第29页 |
| 2.5 IgG亲和纯化(温和法) | 第29-30页 |
| 2.6 IgG亲和纯化(剧烈法) | 第30-31页 |
| 2.7 离子交换层析法纯化蛋白 | 第31-33页 |
| 2.8 密度梯度离心分离纯化蛋白 | 第33-35页 |
| 2.8.1 梯度介质的装填: | 第33-34页 |
| 2.8.2 梯度制备器调节: | 第34页 |
| 2.8.3 密度梯度离心样品的准备 | 第34页 |
| 2.8.4 密度梯度离心样品的配平与离心 | 第34-35页 |
| 2.9 蛋白样品的交联和浓缩 | 第35页 |
| 2.10 电镜样品的制备 | 第35-36页 |
| 2.11 Set2/Set2-RNAPⅡ甲基转移酶活性分析实验 | 第36-37页 |
| 2.12 体外激酶活性分析实验 | 第37页 |
| 2.13 复合物的体外直接组装实验 | 第37-38页 |
| 2.14 Pulldown法体外组装Bur1/2复合物与Spt5/4复合物 | 第38-39页 |
| 2.15 SDS—PAGE凝胶电泳 | 第39-40页 |
| 2.16 Western blot的操作方法 | 第40-41页 |
| 2.17 SDS-PAGE胶的染色方法 | 第41-44页 |
| 2.17.1 考马斯亮蓝法 | 第41页 |
| 2.17.2 Ruby Stain染色法 | 第41-42页 |
| 2.17.3 Pro-Q(?)Diamond磷酸化蛋白质染料法 | 第42-44页 |
| 第3章 不同状态的Set2的纯化及电镜初步分析 | 第44-56页 |
| 3.1 序言 | 第44页 |
| 3.2 游离状态的Set2的初步纯化 | 第44-45页 |
| 3.3 游离状态的Set2的进一步纯化 | 第45-46页 |
| 3.4 游离状态的Set2的交联条件的优化 | 第46-47页 |
| 3.5 游离状态的Set2的电镜数据的初步二维结构解析 | 第47-48页 |
| 3.6 结合在RNAPⅡ上的Set2的纯化 | 第48-49页 |
| 3.7 Set2-RNAPⅡ的IgG纯化结果初步二维分析 | 第49-51页 |
| 3.8 Set2-RNAPⅡ复合物的密度梯度离心纯化 | 第51-53页 |
| 3.9 Set2/Set2-RNAPⅡ的HMT活性分析实验 | 第53-54页 |
| 3.10 本章小结 | 第54-56页 |
| 第4章 RNAPⅡ的激酶复合物Ctk1的相关研究 | 第56-62页 |
| 4.1 序言 | 第56页 |
| 4.2 Ctk1复合物的生化制备 | 第56-57页 |
| 4.3 Ctk1复合物的初步二维结构分析 | 第57-58页 |
| 4.4 Ctk1激酶活性检测 | 第58-60页 |
| 4.5 Ctk1复合物与它的底物RNAPⅡ的体外组装 | 第60-61页 |
| 4.6 本章小结 | 第61-62页 |
| 第5章 Bur1复合物对Spt5/4的调控 | 第62-72页 |
| 5.1 序言 | 第62页 |
| 5.2 Bur1/2复合物的生化制备 | 第62-63页 |
| 5.3 Bur1复合物的初步二维结构分析 | 第63-65页 |
| 5.4 Spt5复合物的生化制备 | 第65-66页 |
| 5.5 Spt5/4二维结构的初步解析 | 第66-67页 |
| 5.6 Bur1/2的激酶活性实验 | 第67-68页 |
| 5.7 体外组装Bur1/2与Spt5/4复合物 | 第68-69页 |
| 5.8 本章小结 | 第69-72页 |
| 第6章 结果总结与讨论 | 第72-74页 |
| 参考文献 | 第74-78页 |
| 致谢 | 第78-80页 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 | 第80页 |
