论文目录 | |
| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-13页 |
| 第一章 前言 | 第13-29页 |
| 1.1 微生物天然产物 | 第13-16页 |
| 1.1.1 天然产物概述 | 第13页 |
| 1.1.2 天然产物的挖掘 | 第13-16页 |
| 1.2 美达霉素 | 第16-19页 |
| 1.3 抗生素生物合成中的糖基化和糖基转移酶 | 第19-20页 |
| 1.4 研究转录调控蛋白的常见方法 | 第20-25页 |
| 1.5 R/ET重组工程 | 第25-27页 |
| 1.5.1 Red/ET重组(Red/ET Recombineering) | 第25-26页 |
| 1.5.2 Red/ET重组技术平台(Red/ET Recombineering) | 第26-27页 |
| 1.6 本研究的目的和意义 | 第27-29页 |
| 1.6.1 研究目的 | 第27-28页 |
| 1.6.2 研究意义 | 第28-29页 |
| 第二章 材料与方法 | 第29-44页 |
| 2.1 菌株 | 第29页 |
| 2.2 质粒 | 第29-30页 |
| 2.3 本研究所用抗生素的浓度 | 第30页 |
| 2.4 酵母培养基中所使用氨基酸的浓度 | 第30-31页 |
| 2.5 培养基 | 第31-34页 |
| 2.5.1 大肠杆菌培养基 | 第31页 |
| 2.5.2 链霉菌培养基 | 第31-32页 |
| 2.5.3 酵母培养基 | 第32-33页 |
| 2.5.4 试剂和溶液 | 第33-34页 |
| 2.6 实验方法 | 第34-44页 |
| 2.6.1 大肠杆菌的基本操作 | 第34-36页 |
| 2.6.2 链霉菌的基本操作 | 第36-39页 |
| 2.6.3 酵母的培养及相关操作 | 第39-40页 |
| 2.6.4 凝胶迁移实验(EMSA)方法 | 第40-44页 |
| 第三章 构建含有med-ORF8突变基因的糖基合成和糖基转移酶基因共表达质粒 | 第44-57页 |
| 3.1 含有突变med-ORF8基因的共表达质粒pAYT55~*的构建 | 第45-50页 |
| 3.1.1 pAYT55-cmccdB质粒的构建 | 第46-49页 |
| 3.1.2 突变质粒pAYT55~*的构建 | 第49-50页 |
| 3.2 重组质粒pAYT55~*在天蓝色链霉菌B135中表达并分析产物 | 第50-55页 |
| 3.2.1 用于接合转移的菌株ET12567/pAYT55~*和ET12567/pAYT55的构建 | 第50-52页 |
| 3.2.2 B135/pAYT55和B135/pAYT55~*的发酵及产物分析 | 第52-55页 |
| 3.3 结果讨论 | 第55-57页 |
| 第四章 探究调控蛋白Med-ORF10与DNA之间的相互作用 | 第57-63页 |
| 4.1 PCR扩增med-ORF29的启动子片段(P_(med-ORF29)) | 第57-58页 |
| 4.2 生物素标记探针Pmed-ORF29及探针标记效率的检测 | 第58-59页 |
| 4.3 蛋白Med-ORF10的表达与纯化 | 第59-60页 |
| 4.4 Med-ORF10蛋白与_(Pmed-ORF29)的结合反应 | 第60-61页 |
| 4.5 结果讨论 | 第61-63页 |
| 第五章 酵母双杂交实验筛选Med-ORF10的可能相互作用蛋白 | 第63-83页 |
| 5.1 诱饵质粒pGADT7-med10的构建 | 第64-66页 |
| 5.2 诱饵质粒pGADT7-med10的自激活及毒性检测 | 第66-68页 |
| 5.2.1 酵母菌株Y2Hgold的表型验证 | 第66页 |
| 5.2.2 诱饵质粒pGADT7-med10的毒性检测 | 第66-67页 |
| 5.2.3 诱饵质粒pGADT7-med10的自激活检测 | 第67-68页 |
| 5.3 链霉菌AM7161基因组文库的构建 | 第68-75页 |
| 5.3.1 链霉菌AM7161基因组总DNA的提取 | 第68页 |
| 5.3.2 基因组DNA的不完全酶切 | 第68-70页 |
| 5.3.3 大规模制备部分酶切的基因组DNA | 第70-71页 |
| 5.3.4 文库载体pGBKT7的处理 | 第71-72页 |
| 5.3.5 载体与文库酶切片段的连接反应 | 第72-73页 |
| 5.3.6 文库质量鉴定 | 第73-74页 |
| 5.3.7 文库质粒制备 | 第74-75页 |
| 5.4 酵母双杂交筛选与Med-ORF10相互作用的蛋白 | 第75-80页 |
| 5.4.1 文库质粒的大规模转化 | 第75页 |
| 5.4.2 阳性克隆的筛选及鉴定 | 第75-78页 |
| 5.4.3 阳性克隆质粒的测序分析 | 第78-80页 |
| 5.5 结果讨论 | 第80-83页 |
| 总结与展望 | 第83-85页 |
| 参考文献 | 第85-90页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第90-91页 |
| 致谢 | 第91页 |
