论文目录 | |
| 摘要 | 第1-5页 |
| abstract | 第5-7页 |
| 本实验所需的器材及试剂 | 第7-13页 |
| 第一章 引言 | 第13-20页 |
| 1.1 亲环蛋白家族(Cyclophilins) | 第13页 |
| 1.2 CypD的相关研究 | 第13-18页 |
| 1.2.1 CypD和MPTP之间的关系 | 第14-15页 |
| 1.2.2 CypD同其他蛋白的相互作用 | 第15-16页 |
| 1.2.3 CypD在疾病上的作用 | 第16-18页 |
| 1.3 本研究的研究意义和目的 | 第18-20页 |
| 第二章 池蝶蚌CypD的原核表达及组织细胞上的定位 | 第20-54页 |
| 2.1 材料 | 第21页 |
| 2.2 方法 | 第21-39页 |
| 2.2.1 池蝶蚌cDNA的合成 | 第21-23页 |
| 2.2.1.1 总RNA的提取 | 第21-22页 |
| 2.2.1.2 RNA质量的检测 | 第22页 |
| 2.2.1.3 反转录全长所需模版 | 第22-23页 |
| 2.2.2 原核表达目的片段cDNA的克隆 | 第23-25页 |
| 2.2.2.1 蛋白表达的引物设计 | 第23页 |
| 2.2.2.2 PCR体系及其反应条件 | 第23-24页 |
| 2.2.2.3 PCR扩增产物的检测 | 第24页 |
| 2.2.2.4 切胶回收纯化PCR产物 | 第24-25页 |
| 2.2.3 原核表达重组载体的构建 | 第25-26页 |
| 2.2.4 原核表达重组载体的构建和双酶切鉴定 | 第26-29页 |
| 2.2.4.1 连接产物的转化 | 第26-27页 |
| 2.2.4.2 阳性重组质粒的筛选 | 第27页 |
| 2.2.4.3 重组质粒的抽提及酶切鉴定 | 第27-29页 |
| 2.2.5 融合蛋白的原核表达 | 第29页 |
| 2.2.5.1 小量诱导表达，步骤如下： | 第29页 |
| 2.2.5.2 大量诱导表达，步骤如下： | 第29页 |
| 2.2.6 融合蛋白的纯化 | 第29-30页 |
| 2.2.7 Bradford法测定蛋白浓度 | 第30-31页 |
| 2.2.8 多克隆抗体的制备 | 第31-32页 |
| 2.2.8.1 阴性抗体的获得 | 第31页 |
| 2.2.8.2 免疫过程 | 第31-32页 |
| 2.2.9 多克隆抗体效价的测定 | 第32页 |
| 2.2.10 Western blot检测抗体的特异性 | 第32-34页 |
| 2.2.10.1 组织蛋白的提取 | 第32-33页 |
| 2.2.10.2 Western blot检测 | 第33-34页 |
| 2.2.11 HE染色检测切片 | 第34页 |
| 2.2.12 免疫荧光定位 | 第34-35页 |
| 2.2.13 构建真核重组质粒的目的片段的获得 | 第35页 |
| 2.2.13.1 PCR引物的设计 | 第35页 |
| 2.2.13.2 PCR反应及片段的纯化 | 第35页 |
| 2.2.14 pEGFP-C1-HsCypD真核重组质粒的构建及提取 | 第35-36页 |
| 2.2.14.1 pEGFP-C1-HsCypD真核重组质粒的构建 | 第35页 |
| 2.2.14.2 pEGFP-C1-HsCypD真核重组质粒和pEGFP-C1空载质粒的提取 | 第35-36页 |
| 2.2.15 肝癌细胞（SMMC-7721）细胞培养和传代 | 第36-38页 |
| 2.2.15.1 细胞复苏和培养 | 第36-37页 |
| 2.2.15.2 细胞的传代 | 第37页 |
| 2.2.15.3 细胞的冻存 | 第37-38页 |
| 2.2.16 细胞转染 | 第38页 |
| 2.2.17 Western blot检测HsCypD过量表达 | 第38-39页 |
| 2.2.17.1 样品的处理 | 第38-39页 |
| 2.2.17.2 Western blot检测 | 第39页 |
| 2.2.18 激光共聚焦显微镜扫描检测带GFP绿色荧光的SMMC-7721 细胞 | 第39页 |
| 2.3 结果和分析 | 第39-52页 |
| 2.3.1 总RNA的提取 | 第39-40页 |
| 2.3.2 原核表达目的片段PCR扩增 | 第40页 |
| 2.3.3 原核表达PCR产物回收 | 第40-41页 |
| 2.3.4 原核表达重组质粒鉴定 | 第41页 |
| 2.3.5 小量诱导结果 | 第41-43页 |
| 2.3.6 超声波破碎后电泳图 | 第43-44页 |
| 2.3.7 融合蛋白的纯化 | 第44-45页 |
| 2.3.8 凝血酶酶切结果 | 第45页 |
| 2.3.9 Bradford法测定蛋白浓度 | 第45-46页 |
| 2.3.10 间接ELISA测定多克隆抗血清效价 | 第46-47页 |
| 2.3.11 抗体的Western blot检测 | 第47页 |
| 2.3.12 HE染色结果 | 第47-48页 |
| 2.3.13 HsCypD在肝胰腺细胞和卵细胞上的免疫荧光定位分析 | 第48-49页 |
| 2.3.14 真核重组质粒的HsCypD目的片段的扩增 | 第49页 |
| 2.3.15 真核重组质粒鉴定 | 第49-50页 |
| 2.3.16 Western blot检测结果真核表达 | 第50-51页 |
| 2.3.17 HsCypD在SMMC-7721 肝癌细胞上的定位情况 | 第51-52页 |
| 2.4 讨论 | 第52-54页 |
| 第三章 池蝶蚌CypD对肝癌细胞SMMC-7721 生长的影响 | 第54-67页 |
| 3.1 实验材料 | 第54-55页 |
| 3.2 实验方法 | 第55-60页 |
| 3.2.1 PCR引物设计 | 第55-56页 |
| 3.2.2 pcDNA3.1(+)-HsCypD重组质粒构建及提取 | 第56页 |
| 3.2.3 肝癌细胞（SMMC-7721）的细胞培养和传代以及细胞转染 | 第56页 |
| 3.2.4 荧光定量PCR检测SMMC-7721 相关凋亡基因的表达变化 | 第56-58页 |
| 3.2.4.1 荧光定量PCR模版的获取 | 第56-57页 |
| 3.2.4.2 荧光定量PCR仪检测SMMC-7721 相关凋亡基因的表达变化 | 第57-58页 |
| 3.2.5 Western blot检测 | 第58页 |
| 3.2.6 流式细胞仪检测 | 第58-59页 |
| 3.2.7 Caspase-3 分光光度法检测试剂盒检测Caspase-3 的活化程度 | 第59-60页 |
| 3.3 实验结果 | 第60-64页 |
| 3.3.1 对凋亡相关因子的表达量的qReal-time PCR检测 | 第60-61页 |
| 3.3.2 Western blot检测结果 | 第61-62页 |
| 3.3.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 | 第62-63页 |
| 3.3.4 Caspase-3 活性检测 | 第63-64页 |
| 3.4 讨论 | 第64-67页 |
| 第四章 结论和展望 | 第67-69页 |
| 4.1 结论 | 第67-68页 |
| 4.2 展望 | 第68-69页 |
| 致谢 | 第69-70页 |
| 参考文献 | 第70-78页 |
| 攻读硕士期间的研究成果 | 第78页 |
