论文目录 | |
| 摘要 | 第1-3页 |
| Abstract | 第3-7页 |
| 引言 | 第7-9页 |
| 1 实验材料 | 第9-11页 |
| 1.1 实验菌株及载体 | 第9页 |
| 1.2 主要实验试剂 | 第9页 |
| 1.3 培养基及溶液的配制 | 第9-10页 |
| 1.4 主要实验仪器 | 第10-11页 |
| 2 实验方法 | 第11-28页 |
| 2.1 重组表达载体的构建 | 第11-20页 |
| 2.1.1 原核重组表达载体的构建 | 第11-18页 |
| 2.1.1.1 pET28a-CHIE4载体质粒提取与检测 | 第11-12页 |
| 2.1.1.2 pMAL-c5x-CHIE4和pMAL-p5x-CHIE4质粒提取与酶切 | 第12-14页 |
| 2.1.1.3 PCR扩增目的基因 | 第14-15页 |
| 2.1.1.4 连接转化实验 | 第15-16页 |
| 2.1.1.5 菌液PCR检测 | 第16-18页 |
| 2.1.2 真核重组表达载体的构建 | 第18-20页 |
| 2.1.2.1 目的基因的制备与载体的酶切 | 第18页 |
| 2.1.2.2 TA-CHIE4-9K载体的构建 | 第18-19页 |
| 2.1.2.3 pPIC9K-CHIE4载体的构建 | 第19页 |
| 2.1.2.4 pPIC9K-CHIE4的线性化处理 | 第19-20页 |
| 2.2 目的蛋白的表达纯化实验 | 第20-26页 |
| 2.2.1 原核表达载体的表达纯化实验 | 第20-24页 |
| 2.2.1.1 表达感受态的制备及转化实验 | 第20页 |
| 2.2.1.2 蛋白诱导表达 | 第20-21页 |
| 2.2.1.3 SDS-PAGE蛋白电泳 | 第21-22页 |
| 2.2.1.4 大量发酵及蛋白纯化 | 第22-23页 |
| 2.2.1.4.1 目的蛋白诱导表达 | 第22页 |
| 2.2.1.4.2 目的蛋白纯化 | 第22-23页 |
| 2.2.1.5 蛋白的复性实验 | 第23-24页 |
| 2.2.1.5.1 包涵体破菌、分离、洗涤及溶解 | 第23页 |
| 2.2.1.5.2 包涵体含量的测定 | 第23页 |
| 2.2.1.5.3 透析复性 | 第23-24页 |
| 2.2.1.5.4 Western-Blot检验蛋白表达 | 第24页 |
| 2.2.2 真核表达载体的诱导表达实验 | 第24-26页 |
| 2.2.2.1 制备GS115酵母感受态 | 第24-25页 |
| 2.2.2.2 电击转化 | 第25-26页 |
| 2.2.2.3 Muts/Mut+ 表型重组酵母的诱导表达筛选 | 第26页 |
| 2.2.2.4 毕赤酵母诱导表达蛋白的SDS-PAGE | 第26页 |
| 2.3 重组蛋白的活性检测实验 | 第26-28页 |
| 2.3.1 标准品的紫外可见光吸收光谱 | 第26-27页 |
| 2.3.2 标准品的紫外可见光吸收光谱 | 第27-28页 |
| 3. 实验结果与分析 | 第28-43页 |
| 3.1 原核重组表达载体构建结果 | 第28-33页 |
| 3.1.1 pET28a-CHIE4载体质粒提取 | 第28页 |
| 3.1.2 pMAL-c5x-CHIE4和pMAL-p5x-CHIE4表达载体的构建 | 第28-33页 |
| 3.1.2.1 目的基因的扩增 | 第29-31页 |
| 3.1.2.2 阳性克隆的鉴定 | 第31-33页 |
| 3.2 真核重组载体构建 | 第33-37页 |
| 3.2.1 目的基因的扩增结果 | 第33-34页 |
| 3.2.2 TA-CHIE4-9K载体阳性克隆的鉴定 | 第34-35页 |
| 3.2.3 pPIC9K-CHIE4载体阳性克隆的鉴定 | 第35-37页 |
| 3.3 原核表达载体的重组表达 | 第37-41页 |
| 3.3.1 pET28a-CHIE4载体的重组表达 | 第37-40页 |
| 3.3.1.1 蛋白复性及Western-Blot鉴定重组表达结果 | 第38-40页 |
| 3.3.2 pMAL-c5x-CHIE4和pMAL-p5x-CHIE4载体的重组表达 | 第40-41页 |
| 3.3.2.1 pMAL-p5x-CHIE4重组表达蛋白的酶切实验结果 | 第40-41页 |
| 3.4 真核表达载体的重组表达 | 第41-43页 |
| 3.4.1 酵母表达的SDS-PAGE及Western-Blot检验结果 | 第41-43页 |
| 4 重组蛋白的酶活实验 | 第43-49页 |
| 4.1 纯化后重组目的蛋白浓度定量 | 第43-44页 |
| 4.2 标准曲线的绘制 | 第44-45页 |
| 4.3 紫外可见光吸收光谱 | 第45-46页 |
| 4.4 辅酶FAD的紫外吸收光谱变化曲线 | 第46页 |
| 4.5 辅酶FMN的紫外吸收光谱变化曲线 | 第46-47页 |
| 4.6 辅酶FAD和FMN的时间梯度的吸光值变化 | 第47-49页 |
| 5 讨论 | 第49-51页 |
| 6 结论 | 第51-52页 |
| 参考文献 | 第52-55页 |
| 综述 | 第55-72页 |
| 1. 海洋链霉菌概述 | 第55-56页 |
| 2. 关于海洋链霉菌次级代谢产物的最新研究内容 | 第56-58页 |
| 2.1 生物碱 | 第56-57页 |
| 2.2 大环内酯类 | 第57页 |
| 2.3 聚酮化合物 | 第57页 |
| 2.4 其他活性物质 | 第57-58页 |
| 3. 手霉素类化合物 | 第58-61页 |
| 4. 链霉菌M-045 概述 | 第61-64页 |
| 4.1 链霉菌M-045 的来源 | 第61页 |
| 4.2 链霉菌M045初级代谢过程 | 第61页 |
| 4.3 海洋链霉菌M045的分泌系统 | 第61-62页 |
| 4.3 链霉菌M045的次级代谢过程 | 第62页 |
| 4.4 链霉菌M045中手霉素A和中尼霉素生物合成基因研究 | 第62-64页 |
| 5. 氧化还原酶研究进展 | 第64-66页 |
| 5.1 辅酶依赖的氧化还原酶 | 第65-66页 |
| 6. 小结与展望 | 第66-67页 |
| 综述参考文献 | 第67-72页 |
| 攻读学位期间研究成果 | 第72-73页 |
| 致谢 | 第73-74页 |
