论文目录 | |
| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-12页 |
| 第一部分 前言 | 第12-20页 |
| 1.1 BT毒素杀虫晶体蛋白(ICPs)的分类 | 第12-14页 |
| 1.2 已报道的昆虫中肠毒素受体及其分类 | 第14-17页 |
| 1.2.1 钙粘蛋白(Cadherin) | 第14-15页 |
| 1.2.2 氨肽酶N(APN) | 第15-16页 |
| 1.2.3 碱性磷酸酶(ALP) | 第16-17页 |
| 1.2.4 糖脂 | 第17页 |
| 1.2.5 其他受体 | 第17页 |
| 1.3 受体与毒素蛋白之间的相互作用 | 第17-18页 |
| 1.4 昆虫对Bt毒素的抗性机制 | 第18-19页 |
| 1.4.1 蛋白酶介导的抗性 | 第18-19页 |
| 1.4.2 昆虫的Bt蛋白受体改变介导的抗性 | 第19页 |
| 1.4.3 Bt蛋白与受体结合改变介导的抗性 | 第19页 |
| 1.5 课题研究意义 | 第19-20页 |
| 第二部分 实验材料 | 第20-26页 |
| 2.1 细胞系和细胞培养 | 第20页 |
| 2.2 实验试剂及实验药品 | 第20-21页 |
| 2.3 菌种及质粒 | 第21页 |
| 2.4 培养基及溶液的配制 | 第21-25页 |
| 2.4.1 DNA及蛋白凝胶电泳相关的溶液配制 | 第21-22页 |
| 2.4.2 细菌和细胞培养相关的溶液 | 第22-23页 |
| 2.4.3 常用的实验缓冲液配方(1L配方) | 第23页 |
| 2.4.4 蛋白纯化相关的溶液 | 第23-24页 |
| 2.4.5 SDS-PAGE及Westem-Blot缓冲液的配制 | 第24页 |
| 2.4.6 SDS-PAGE凝胶的配制 | 第24-25页 |
| 2.5 实验仪器及型号 | 第25-26页 |
| 第三部分 实验方法与步骤 | 第26-40页 |
| 3.1 细胞RNA的提取 | 第26页 |
| 3.2 碱裂解法提质粒 | 第26-27页 |
| 3.3 Cry1Ac毒素的提取 | 第27-28页 |
| 3.4 活细胞免疫荧光检测受体在膜上的定位 | 第28页 |
| 3.5 免疫荧光检测受体蛋白在细胞中的定位 | 第28页 |
| 3.6 转染细胞(24孔板) | 第28-29页 |
| 3.7 ALP,APN,Cadherin表达质粒的构建 | 第29-34页 |
| 3.7.1 pET-28a-ALP原核表达质粒的构建 | 第29页 |
| 3.7.2 ALP,APN,Cadherin真核表达质粒的构建 | 第29-34页 |
| 3.8 细胞水平上通过免疫荧光检测CrylAc与毒素受体相互作用 | 第34-35页 |
| 3.9 受体介导的CrylAc毒力分析 | 第35页 |
| 3.10 CrylAc处理细胞后细胞释放的乳酸脱氢酶(LDH)检测 | 第35-36页 |
| 3.11 免疫印迹(Western blot)检测受体表达 | 第36页 |
| 3.12 ALP蛋白的表达纯化及抗体的制备 | 第36-38页 |
| 3.12.1 ALP蛋白的表达纯化 | 第36-37页 |
| 3.12.2 ALP蛋白抗体的制备 | 第37-38页 |
| 3.13 BCA法测定蛋白浓度 | 第38页 |
| 3.14 重叠PCR技术 | 第38-40页 |
| 第四部分 实验结果 | 第40-67页 |
| 4.1 CrylAc毒素蛋白的提取 | 第40页 |
| 4.2 ALP蛋白原核表达纯化及抗体的制备 | 第40-42页 |
| 4.3 受体ALP重组真核表达载体的构建 | 第42-48页 |
| 4.3.1 pEGFP-N1-IE_2-ALP-GFP-GPI真核表达载体的构建 | 第42-44页 |
| 4.3.2 pEGFP-N1-IE_2-ALP-GFP-9-GPI真核表达载体的构建 | 第44-45页 |
| 4.3.3 pEGFP-N1-IE_2-N-S-GFP-ALP真核表达载体的构建 | 第45页 |
| 4.3.4 pEGFP-N1-IE_2-ALP-GFP真核表达载体的构建 | 第45-46页 |
| 4.3.5 pEGFP-N1-IE_2-ALP-stop真核表达载体的构建 | 第46-48页 |
| 4.4 ALP蛋白在TH细胞内的定位 | 第48-49页 |
| 4.5 活细胞免疫荧光检测ALP在TH细胞内的定位 | 第49-50页 |
| 4.6 受体APN重组真核表达载体的构建 | 第50-52页 |
| 4.6.1 pEGFP-N1-IE_2-APN-GFP-GPI真核表达载体的构建 | 第50-51页 |
| 4.6.2 pEGFP-N1-IE_2-N-signal-GFP-APN真核表达载体的构建 | 第51-52页 |
| 4.7 APN蛋白在TH细胞内的定位 | 第52-53页 |
| 4.8 活细胞免疫荧光检测APN在TH细胞内的定位 | 第53页 |
| 4.9 受体Cadherin重组真核表达载体的构建 | 第53-57页 |
| 4.9.1 pIE_2—Mcherry-Cadherin融合表达载体构建 | 第53-54页 |
| 4.9.2 pIE_2—EGFP-Cadherin融合表达载体的构建 | 第54-55页 |
| 4.9.3 pIE_2—EGFP-Cadherin-stop真核表达载体的构建 | 第55-57页 |
| 4.10 Cadherin蛋白在TH细胞内的定位 | 第57-58页 |
| 4.11 ALP在TH细胞内的表达 | 第58-60页 |
| 4.12 CrylAc与毒素受体细胞水平上相互作用 | 第60页 |
| 4.13 三种受体介导的Cry1Ac毒力分析(TH细胞) | 第60-62页 |
| 4.14 CrylAc毒素处理细胞后细胞内乳酸脱氢酶(LDH)释放量检测 | 第62-64页 |
| 4.15 pEGFP-N1-IE_2-ALP-TBR-GFP-GPI真核表达载体的构建 | 第64页 |
| 4.16 活细胞免疫荧光检测ALP-TBR-GFP-GPI融合蛋白在TH细胞内的定位 | 第64-65页 |
| 4.17 Cadherin的毒素结合区域TBR插到受体ALP后介导的Cry1AC毒素毒力分析 | 第65-67页 |
| 第五部分 总结与讨论 | 第67-69页 |
| 5.1 本论文实验总结 | 第67页 |
| 5.2 本实验讨论部分 | 第67-69页 |
| 参考文献 | 第69-73页 |
| 附录 | 第73-74页 |
| 在校期间发表论文 | 第74-75页 |
| 致谢 | 第75页 |
