论文目录 | |
| 摘要 | 第1-12页 |
| Abstract | 第12-15页 |
| 缩略语表 | 第15-16页 |
| 第一章 Zwittermicin A标准品的纯化制备及发酵样品中zwittermicin A含量的绝对定量 | 第16-37页 |
| 1 前言 | 第16-23页 |
| 1.1 次级代谢产物的分离纯化 | 第16-18页 |
| 1.1.1 样品预处理 | 第16页 |
| 1.1.2 样品初分离 | 第16-17页 |
| 1.1.3 样品精制 | 第17-18页 |
| 1.2 Zwittermicin A的分离纯化 | 第18-22页 |
| 1.2.1 Zwittermicin A的结构及性质 | 第18-19页 |
| 1.2.2 Zwittermicin A的纯化方法及效果 | 第19-22页 |
| 1.3 本研究的目的及新意 | 第22-23页 |
| 2 材料与方法 | 第23-26页 |
| 2.1 实验材料 | 第23页 |
| 2.1.1 试剂 | 第23页 |
| 2.1.2 柱填料及仪器 | 第23页 |
| 2.2 实验方法 | 第23-26页 |
| 2.2.1 Zwittermicin A纯品制备方法 | 第23-25页 |
| 2.2.1.1 发酵液预处理 | 第23页 |
| 2.2.1.2 阳离子交换 | 第23-24页 |
| 2.2.1.3 薄层层析 | 第24页 |
| 2.2.1.4 硅胶柱层析 | 第24页 |
| 2.2.1.5 高效液相色谱纯品制备及分析 | 第24-25页 |
| 2.2.2 发酵样品中zwittermicin A的快速定量 | 第25-26页 |
| 2.2.2.1 发酵液预处理 | 第25页 |
| 2.2.2.2 阳离子交换 | 第25页 |
| 2.2.2.3 液相色谱定量 | 第25页 |
| 2.2.2.4 一级质谱定量 | 第25-26页 |
| 3 结果与分析 | 第26-36页 |
| 3.1 Zwittermicin A纯品的分离制备 | 第26-33页 |
| 3.1.1 发酵液预处理对活性物质的抑菌能力影响 | 第26页 |
| 3.1.2 洗脱收集液pH突变前后的抑菌能力分析 | 第26-27页 |
| 3.1.3 硅胶柱层析对zwittermicin A的分离效果分析 | 第27-29页 |
| 3.1.3.1 硅胶柱层析步骤的必要性 | 第27页 |
| 3.1.3.2 薄层层析展层条件的摸索 | 第27-29页 |
| 3.1.3.3 硅胶柱层析分离zwittermicin A过程 | 第29页 |
| 3.1.4 Zwittermicin A纯品制备及定量分析的液相条件摸索 | 第29-31页 |
| 3.1.5 Zwittermicin A纯品制备结果 | 第31-33页 |
| 3.2 发酵样品中zwittermicin A含量的绝对定量 | 第33-36页 |
| 3.2.1 发酵样品初提纯的必要性 | 第33页 |
| 3.2.2 发酵样品初提纯的方法探索 | 第33页 |
| 3.2.3 发酵样品初提样中zwittermicin A含量的定量结果 | 第33-36页 |
| 3.2.3.1 Zwittermicin A标准曲线的制作 | 第34-35页 |
| 3.2.3.2 定量结果 | 第35-36页 |
| 3.3 小结 | 第36页 |
| 4 讨论 | 第36-37页 |
| 第二章 抗生素zwittermicin A生物合成基因簇中关键基因的功能研究 | 第37-95页 |
| 1、前言 | 第37-59页 |
| 1.1 抗生素的定义及分类 | 第37-42页 |
| 1.1.1 核糖体肽类 | 第37-38页 |
| 1.1.2 非核糖体肽类 | 第38-39页 |
| 1.1.3 聚酮类 | 第39-41页 |
| 1.1.3.1 一型聚酮 | 第39-40页 |
| 1.1.3.2 二型聚酮 | 第40页 |
| 1.1.3.3 三型聚酮 | 第40-41页 |
| 1.1.3.4 其它 | 第41页 |
| 1.1.4 非核糖体肽-聚酮杂合类 | 第41-42页 |
| 1.1.5 其它 | 第42页 |
| 1.2 抗生素zwittermicin A生物合成研究基础 | 第42-57页 |
| 1.2.1 Zwittermicin A的发现 | 第42-43页 |
| 1.2.2 Zwittermicin A的性质 | 第43-44页 |
| 1.2.2.1 Zwittermicin A的抑菌性质 | 第43页 |
| 1.2.2.2 Zwittermicin A的增效性质 | 第43-44页 |
| 1.2.3 Zwittermicin A的作用机制 | 第44页 |
| 1.2.4 Zwittermicin A的生物合成基因簇研究 | 第44-46页 |
| 1.2.5 Zwittermicin A的生物合成途径研究 | 第46-48页 |
| 1.2.6 Zwittermicin A生物合成相关基因功能的研究 | 第48-57页 |
| 1.2.6.1 zmaR基因功能的研究 | 第48-49页 |
| 1.2.6.2 zmaS基因功能的初步研究 | 第49-52页 |
| 1.2.6.3 zmaM基因功能的初步研究 | 第52-53页 |
| 1.2.6.4 Zwittermicin A释放机制的研究 | 第53-57页 |
| 1.3 本研究的目的及新颖性 | 第57-59页 |
| 2 材料与方法 | 第59-68页 |
| 2.1 实验材料 | 第59-64页 |
| 2.1.1 菌株、质粒和引物 | 第59页 |
| 2.1.2 培养基 | 第59页 |
| 2.1.3 试剂 | 第59-64页 |
| 2.1.3.1 抽质粒用试剂 | 第59页 |
| 2.1.3.2 抽芽胞杆菌总DNA用试剂 | 第59页 |
| 2.1.3.3 大肠杆菌感受态制备试剂 | 第59页 |
| 2.1.3.4 芽胞杆菌感受态制备试剂 | 第59-60页 |
| 2.1.3.5 蛋白操作用试剂 | 第60-64页 |
| 2.1.3.6 其它 | 第64页 |
| 2.1.4 仪器 | 第64页 |
| 2.2 实验方法 | 第64-68页 |
| 2.2.1 DNA操作方法 | 第64-66页 |
| 2.2.1.1 大肠杆菌质粒的抽提 | 第64页 |
| 2.2.1.2 蜡状芽胞杆菌质粒的抽提 | 第64-65页 |
| 2.2.1.3 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第65页 |
| 2.2.1.4 蜡状芽胞杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第65页 |
| 2.2.1.5 蜡状芽胞杆菌总DNA的抽提 | 第65-66页 |
| 2.2.1.6 体外重组实验 | 第66页 |
| 2.2.2 蛋白质操作方法 | 第66-67页 |
| 2.2.2.1 蛋白质的诱导表达 | 第66页 |
| 2.2.2.2 蛋白质的纯化 | 第66页 |
| 2.2.2.3 蛋白质的脱盐 | 第66页 |
| 2.2.2.4 蛋白质的纯度检测及定量 | 第66-67页 |
| 2.2.2.5 蛋白质体外催化实验 | 第67页 |
| 2.2.2.6 MALDI-TOF-TOF检测蛋白催化结果 | 第67页 |
| 2.2.3 Zwittermicin A的检测方法 | 第67页 |
| 2.2.3.1 Zwittermicin A的活性检测 | 第67页 |
| 2.2.3.2 Zwittermicin A的质谱检测 | 第67页 |
| 2.2.4 序列分析方法 | 第67-68页 |
| 2.2.4.1 核酸序列分析 | 第67页 |
| 2.2.4.2 蛋白质序列分析 | 第67-68页 |
| 3 结果与分析 | 第68-90页 |
| 3.1 PPTase编码基因zmaS的功能研究 | 第68-78页 |
| 3.1.1 前期基础及本研究技术路线 | 第68页 |
| 3.1.2 zmaS对zwittermicin A和kanosamine的调控能力分析 | 第68-70页 |
| 3.1.2.1 UW85及UW86 72h发酵上清抑菌能力分析 | 第68页 |
| 3.1.2.2 UW85及UW86 72h发酵上清纯化后抑菌能力分析 | 第68-69页 |
| 3.1.2.3 UW85及UW86中zwittermicin A及kanosamine产量分析 | 第69-70页 |
| 3.1.3 zmaS对kanosamine的调控水平分析 | 第70-73页 |
| 3.1.3.1 pBMB1962及pBMB1963的构建与验证 | 第70-71页 |
| 3.1.3.2 pBMB1962及pBMB1963转化宿主菌UW85与验证 | 第71-72页 |
| 3.1.3.3 BMB1969、BMB1970和BMB1971的抑菌能力分析 | 第72页 |
| 3.1.3.4 BMB1969、BMB1970和BMB1971中zwittermicin A及kanosamine产量分析 | 第72-73页 |
| 3.1.4 zmaS的PPTase催化功能体外验证 | 第73-76页 |
| 3.1.4.1 ZmaS体外催化用蛋白的分离纯化 | 第73-75页 |
| 3.1.4.2 ZmaS体外催化条件的摸索 | 第75-76页 |
| 3.1.4.3 ZmaS体外催化反应结果的质谱检测 | 第76页 |
| 3.1.5 小结 | 第76-78页 |
| 3.2 双功能域编码基因zmaM的功能研究 | 第78-86页 |
| 3.2.1 前期基础及本研究技术路线 | 第78页 |
| 3.2.2 BMB1354、BMB1355和UW85的抑菌能力比较 | 第78-79页 |
| 3.2.3 BMB1354、BMB1355和UW85中zwittermicin A及kanosamine的产量分析 | 第79-80页 |
| 3.2.4 BMB1354、BMB1355和UW85中胞内外乙酰化zwittermicin A产量分析 | 第80-81页 |
| 3.2.5 基于YBT-1520基因组的zmaM类似功能蛋白分析 | 第81-82页 |
| 3.2.6 小结 | 第82-86页 |
| 3.3 Zwittermicin A释放机制的研究 | 第86-90页 |
| 3.3.1 前期基础及本研究技术路线 | 第86页 |
| 3.3.2 Zwittermicin A Te释放机制突变体相关载体构建与验证 | 第86-87页 |
| 3.3.3 Zwittermicin A Te释放机制突变体筛选与表型检测 | 第87页 |
| 3.3.4 Zwittermicin A Te释放机制突变体的活性物质产生情况分析 | 第87-89页 |
| 3.3.5 小结 | 第89-90页 |
| 4 讨论 | 第90-95页 |
| 4.1 zmaS的功能研究 | 第90-91页 |
| 4.2 zmaM的功能研究 | 第91-93页 |
| 4.3 Zwittermicin A释放机制的研究 | 第93-95页 |
| 参考文献 | 第95-99页 |
| 致谢 | 第99-101页 |
| 附录 | 第101页 |
