论文目录 | |
| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-27页 |
| 1 研究背景 | 第11-12页 |
| 2 β-葡萄糖苷酶研究进展 | 第12-13页 |
| 3 β-葡萄糖苷酶分离纯化 | 第13-14页 |
| 3.1 硫酸铵沉淀法 | 第13页 |
| 3.2 亲和层析法 | 第13页 |
| 3.3 离子交换色谱法 | 第13-14页 |
| 3.4 凝胶层析法 | 第14页 |
| 3.5 疏水层析 | 第14页 |
| 4 β-葡萄糖苷酶性质研究 | 第14-17页 |
| 4.1 分子量 | 第14-15页 |
| 4.2 温度 | 第15页 |
| 4.3 pH | 第15页 |
| 4.4 底物特异性 | 第15-16页 |
| 4.5 抑制剂 | 第16页 |
| 4.6 激活因子 | 第16页 |
| 4.7 动力学参数 | 第16-17页 |
| 5 β-葡萄糖苷酶结构及功能研究 | 第17-18页 |
| 6 β-葡萄糖苷酶催化反应机制 | 第18页 |
| 7 β-葡萄糖苷酶活性检测 | 第18-19页 |
| 7.1 pNPG法 | 第18页 |
| 7.2 荧光法 | 第18-19页 |
| 7.3 DNS法 | 第19页 |
| 7.4 京尼平苷法测酶活 | 第19页 |
| 8 β-葡萄糖苷酶的应用 | 第19-22页 |
| 8.1 β-葡萄糖苷酶在纤维素降解中的应用 | 第19页 |
| 8.2 在食品工业中的应用 | 第19-20页 |
| 8.3 水解京尼平苷 | 第20页 |
| 8.4 在农业中的应用 | 第20-21页 |
| 8.5 在医学领域的应用 | 第21页 |
| 8.6 工业上生产燃料乙醇 | 第21页 |
| 8.7 β-葡萄糖苷酶其他应用 | 第21-22页 |
| 9 β-葡萄糖苷酶基因克隆与表达研究 | 第22-24页 |
| 9.1 β-葡萄糖苷酶在原核系统中的表达 | 第22-23页 |
| 9.2 β-葡萄糖苷酶在毕赤酵母中的表达 | 第23-24页 |
| 10 本课题研究的目的意义 | 第24-26页 |
| 11 研究内容与技术路线 | 第26-27页 |
| 第二章 材料和方法 | 第27-57页 |
| 1 主要仪器设备 | 第27-28页 |
| 2 实验材料、试剂及培养基 | 第28-29页 |
| 2.1 供试菌株与质粒 | 第28页 |
| 2.2 试剂与酶 | 第28-29页 |
| 2.3 培养基与贮备液 | 第29页 |
| 3 培养方法 | 第29页 |
| 3.1 黑曲霉培养 | 第29页 |
| 3.2 大肠杆菌培养 | 第29页 |
| 3.3 毕赤酵母GS115培养 | 第29页 |
| 4 试验方法 | 第29-57页 |
| 4.1 RNAiso Plus提取黑曲霉总RNA | 第29-30页 |
| 4.2 2×CTAB法提取黑曲霉基因组 | 第30-31页 |
| 4.3 β-葡萄糖苷酶基因引物设计 | 第31-32页 |
| 4.4 RT-PCR获得β-葡萄糖苷酶基因cDNA序列 | 第32-33页 |
| 4.5 PCR获得β-葡萄糖苷酶基因DNA序列 | 第33页 |
| 4.6 目的基因转化大肠杆菌Trans1-T1 | 第33-36页 |
| 4.7 酶切鉴定阳性重组子 | 第36-37页 |
| 4.8 目的基因测序验证与分析 | 第37页 |
| 4.9 重组pET28a表达载体的构建 | 第37-40页 |
| 4.10 重组pET32a表达载体的构建 | 第40-42页 |
| 4.11 重组pPIC9K表达载体的构建 | 第42-44页 |
| 4.12 重组pPICZaA表达载体的构建 | 第44-49页 |
| 4.13 重组表达载体pET28a及pET32a转化大肠杆菌BL21(DE3) | 第49页 |
| 4.14 重组表达载体pPIC9K及pPICZαA转化毕赤酵母GS115 | 第49-51页 |
| 4.15 GS115重组子的筛选及表型鉴定 | 第51-52页 |
| 4.16 重组子BL21(DE3)的诱导表达及β-葡萄糖苷酶活性检测 | 第52-53页 |
| 4.17 重组毕赤酵母GS115的诱导表达 | 第53页 |
| 4.18 β-葡萄糖苷酶及其活性检测 | 第53-55页 |
| 4.19 β-葡萄糖苷酶的分离纯化 | 第55-57页 |
| 第三章 结果与分析 | 第57-74页 |
| 1 β-葡萄糖苷酶基因的克隆 | 第57-67页 |
| 1.1 黑曲霉总RNA提取与RT-PCR | 第57-58页 |
| 1.2 黑曲霉基因组DNA提取及PCR扩增β-葡萄糖苷酶基因 | 第58页 |
| 1.3 目的基因转化大肠杆菌Trans1-T1 | 第58-60页 |
| 1.4 测序验证与分析 | 第60-62页 |
| 1.5 重组表达载体pET28a及pET32a的构建 | 第62-65页 |
| 1.6 重组表达载体pPIC9K及pPICZA的构建 | 第65-66页 |
| 1.7 毕赤酵母重组子筛选及表型验证 | 第66-67页 |
| 2 重组BL21(DE3)的诱导表达及β-葡萄糖苷酶检测 | 第67-69页 |
| 2.1 pNPG法检测β-葡萄糖苷酶活性 | 第67-68页 |
| 2.2 七叶苷平板法检测β-葡萄糖苷酶活性 | 第68页 |
| 2.3 SDS-PAGE检测表达产物 | 第68-69页 |
| 3 重组毕赤酵母诱导表达及β-葡萄糖苷酶活性检测 | 第69-72页 |
| 3.1 七叶苷法检测pPIC9K载体重组酵母诱导产物β-葡萄糖苷酶活性 | 第69-70页 |
| 3.2 pNPG法检测pPICZaA载体重组酵母诱导产β-葡萄糖苷酶活性 | 第70-72页 |
| 4 β-葡萄糖苷酶的分离纯化 | 第72-74页 |
| 4.1 硫酸铵沉淀法分离纯化β-葡萄糖苷酶 | 第72页 |
| 4.2 Ni柱亲和层析 | 第72-74页 |
| 结果与讨论 | 第74-76页 |
| 展望 | 第76-77页 |
| 附录 | 第77-83页 |
| (一) 培养基与贮备液 | 第77-79页 |
| (二) β-葡萄糖苷酶基因cDNA序列 | 第79-80页 |
| (三) β-葡萄糖苷酶基因氨基酸序列预测 | 第80-81页 |
| (四) β-葡萄糖苷酶基因DNA序列 | 第81-83页 |
| 参考文献 | 第83-95页 |
| 致谢 | 第95页 |
