论文目录 | |
| 中文摘要 | 第11-12页 |
| ABSTRACT | 第12-15页 |
| 符号说明 | 第15-16页 |
| 第一章 前言 | 第16-26页 |
| 1. 蛋白质的O-GlcNAc修饰 | 第16-18页 |
| 2. 己糖激酶在肿瘤中的作用 | 第18-22页 |
| 2.1 糖酵解途径和肿瘤细胞的Warburg效应 | 第19-20页 |
| 2.2 己糖激酶及其与肿瘤的关系 | 第20-22页 |
| 3. CRISPR/Cas9系统 | 第22-24页 |
| 3.1 CRISPR/Cas9系统的结构及作用原理 | 第22-24页 |
| 3.2 CRISPR/Cas9的优缺点 | 第24页 |
| 4. 本课题的研究意义 | 第24-25页 |
| 5. 本课题拟解决的问题 | 第25-26页 |
| 第二章 HK2蛋白和OGT蛋白的表达与纯化 | 第26-44页 |
| 1. 实验材料 | 第26-29页 |
| 1.1 菌株、质粒、细胞株 | 第26页 |
| 1.2 主要试剂 | 第26-28页 |
| 1.3 仪器设备 | 第28-29页 |
| 2. 实验方法及步骤 | 第29-36页 |
| 2.1 确认HK2是O-GlcNAc糖基化蛋白 | 第29-31页 |
| 2.2 HK2原核表达载体pET28a/HK2的构建以及HK2蛋白的表达与纯化 | 第31-36页 |
| 2.3 OGT蛋白的表达以及纯化 | 第36页 |
| 3. 实验结果 | 第36-42页 |
| 3.1 免疫沉淀实验确认HK2是O-GlcNAc糖基化蛋白质 | 第36-37页 |
| 3.2 重组质粒pET28a/HK2的构建 | 第37-38页 |
| 3.3 目的蛋白HK2的诱导表达、纯化以及复性 | 第38-40页 |
| 3.4 OGT蛋白的表达与纯化 | 第40-42页 |
| 4. 讨论 | 第42-44页 |
| 第三章 HK2蛋白的O-GlcNAc糖基化位点的鉴定 | 第44-55页 |
| 1. 实验材料 | 第44页 |
| 1.1 细胞株、质粒 | 第44页 |
| 1.2 主要试剂 | 第44页 |
| 1.3 仪器设备 | 第44页 |
| 2. 实验方法及步骤 | 第44-48页 |
| 2.1 体外标记O-GlcNAc | 第44-45页 |
| 2.2 MS测定O-GlcNAc糖基化位点 | 第45页 |
| 2.3 HK2 O-GlcNAc糖基化位点的进一步鉴定 | 第45-48页 |
| 3. 实验结果 | 第48-53页 |
| 3.1 体外标记O-GlcNAC | 第48-49页 |
| 3.2 MS结果 | 第49-50页 |
| 3.3 构建O-GlcNAc糖基化位点突变的HK2表达载体 | 第50-52页 |
| 3.4 Western blotting进一步检测糖基化位点 | 第52-53页 |
| 4. 讨论 | 第53-55页 |
| 第四章 内源性HK2基因敲除细胞株的构建 | 第55-69页 |
| 1. 实验材料 | 第55页 |
| 1.1 细胞株、质粒 | 第55页 |
| 1.2 主要试剂 | 第55页 |
| 1.3 仪器设备 | 第55页 |
| 2. 实验方法以及步骤 | 第55-61页 |
| 2.1 靶序列重组载体的构建 | 第55-59页 |
| 2.2 人乳腺癌细胞的转染及突变效率的检测 | 第59-61页 |
| 2.3 HK2基因敲除的单克隆MDA-MB-231细胞株的构建 | 第61页 |
| 3. 实验结果 | 第61-67页 |
| 3.1 lentiCRISPRv2质粒单酶切结果 | 第61-63页 |
| 3.2 T7核酸内切酶I(T7EI)酶切实验结果 | 第63-66页 |
| 3.3 Western blotting验证敲除效果 | 第66-67页 |
| 4. 讨论 | 第67-69页 |
| 全文总结 | 第69-71页 |
| 参考文献 | 第71-77页 |
| 致谢 | 第77-78页 |
| 攻读硕士期间发表的论文 | 第78-79页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第79页 |
