论文目录 | |
| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-14页 |
| 缩略语 | 第14-15页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-22页 |
| 1 膜蛋白的研究 | 第15-16页 |
| 2 昆虫杆状病毒表达载体系统 | 第16-19页 |
| 2.1 杆状病毒 | 第16-17页 |
| 2.2 昆虫杆状病毒表达系统 | 第17-18页 |
| 2.3 家蚕/BmNPV表达系统相对于Sf细胞/AcMNPV表达系统的优势 | 第18页 |
| 2.4 大肠杆菌-昆虫细胞穿梭载体系统(Bac-to-Bac) | 第18-19页 |
| 3 多角体蛋白 | 第19-20页 |
| 4 感觉神经元膜蛋白 | 第20-22页 |
| 第二章 实验设计方案 | 第22-25页 |
| 1 实验目的、意义 | 第22页 |
| 2 实验内容 | 第22-24页 |
| 3 实验流程图 | 第24-25页 |
| 第三章 生物信息学分析 | 第25-33页 |
| 1 序列与工具 | 第25页 |
| 1.1 序列 | 第25页 |
| 1.2 工具 | 第25页 |
| 2 方法 | 第25-26页 |
| 3 结果 | 第26-32页 |
| 3.1 BmSNMP基因的序列分析 | 第26-28页 |
| 3.2 BmSNMP蛋白的疏水性分析 | 第28页 |
| 3.3 BmSNMP蛋白的跨膜分析 | 第28-29页 |
| 3.4 BmSNMP蛋白的信号肽分析 | 第29页 |
| 3.5 BmSNMP蛋白的亚细胞定位分析 | 第29-30页 |
| 3.6 BmSNMP蛋白的二级结构预测 | 第30页 |
| 3.7 BmSNMP蛋白的三级结构预测 | 第30页 |
| 3.8 氨基酸序列同源性分析 | 第30-32页 |
| 4 讨论 | 第32-33页 |
| 第四章 家蚕BmSNMP基因融合polh基因的表达载体构建 | 第33-47页 |
| 1 材料与试剂 | 第33-35页 |
| 1.1 菌种 | 第33页 |
| 1.2 试剂 | 第33页 |
| 1.3 主要试剂的配置 | 第33-35页 |
| 2 方法 | 第35-43页 |
| 2.1 家蚕组织总RNA的提取和cDNA的合成 | 第35-37页 |
| 2.1.1 组织RNA的提取 | 第35-36页 |
| 2.1.2 cDNA第一链的合成 | 第36-37页 |
| 2.2 BmSNMP基因的PCR扩增 | 第37-38页 |
| 2.3 重组质粒pBacPAK8-polh-tev-BmSNMP的构建 | 第38-39页 |
| 2.3.1 纯化回收的目的基因BmSNMP和pBacPAK8-polh-tev的双酶切 | 第38页 |
| 2.3.2 连接反应 | 第38-39页 |
| 2.4 用CaCl_2法制备E.coli TG1、BL21(DE3)感受态细胞 | 第39页 |
| 2.5 连接产物的转化 | 第39-40页 |
| 2.6 重组质粒的筛选和鉴定 | 第40-41页 |
| 2.6.1 提取重组质粒 | 第40页 |
| 2.6.2 重组质粒的PCR及双酶切鉴定 | 第40-41页 |
| 2.6.3 重组质粒的测序鉴定 | 第41页 |
| 2.7 构建重组载体pET-32a(+)-polh-tev-BmSNMP | 第41-43页 |
| 2.7.1 重组载体pBacPAK8-polh-tev-BmSNMP和pET-32a(+)的双酶切 | 第41-42页 |
| 2.7.2 连接反应 | 第42页 |
| 2.7.3 连接产物的转化 | 第42页 |
| 2.7.4 重组克隆的筛选和鉴定 | 第42-43页 |
| 3 结果 | 第43-46页 |
| 3.1 PCR扩增目的片段 | 第43-44页 |
| 3.2 重组质粒pBacPAK8-polh-tev-BmSNMP鉴定 | 第44页 |
| 3.3 序列测定 | 第44-45页 |
| 3.4 目的片段polh-tev-BmSNMP双酶切回收 | 第45页 |
| 3.5 重组载体pET-32a(+)-polh-tev-BmSNMP鉴定 | 第45-46页 |
| 4 讨论 | 第46-47页 |
| 第五章 重组蛋白的表达和纯化 | 第47-56页 |
| 1 材料与试剂 | 第47-49页 |
| 1.1 材料 | 第47页 |
| 1.2 试剂 | 第47页 |
| 1.3 主要试剂的配制 | 第47-49页 |
| 2 方法 | 第49-52页 |
| 2.1 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 | 第49-50页 |
| 2.2 通过pH值调节和离心分离纯化蛋白Polh-tev-BmSNMP | 第50页 |
| 2.3 Western blotting鉴定蛋白表达 | 第50-52页 |
| 2.4 Polh-tev-BmSNMP蛋白的TEV酶消化 | 第52页 |
| 3 结果 | 第52-55页 |
| 3.1 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 | 第52页 |
| 3.2 调节pH值粗纯化融合蛋白Polh-BmSNMP | 第52-53页 |
| 3.3 阴离子交换层析及Western blotting鉴定纯化条带 | 第53-54页 |
| 3.4 纯化融合蛋白的TEV酶酶切 | 第54-55页 |
| 4 讨论 | 第55-56页 |
| 第六章 家蚕BmSNMP基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达 | 第56-73页 |
| 1 材料与试剂 | 第56-57页 |
| 1.1 材料 | 第56页 |
| 1.2 试剂 | 第56页 |
| 1.3 试剂配制 | 第56-57页 |
| 2 方法 | 第57-64页 |
| 2.1 引物设计 | 第57-58页 |
| 2.2 重组载体pFastBac HTb-polh-tev-BmSNMP的构建 | 第58页 |
| 2.3 产物连接及转化 | 第58页 |
| 2.4 重组基因组Bacmid-polh-BmSNMP的构建 | 第58-60页 |
| 2.4.1 DH10Bac菌感受态的制备 | 第58-59页 |
| 2.4.2 重组质粒的转化 | 第59页 |
| 2.4.3 重组Bacmid的提取 | 第59页 |
| 2.4.4 重组Bacmid PCR鉴定 | 第59-60页 |
| 2.5 细胞培养与冻存、复苏 | 第60-61页 |
| 2.5.1 家蚕细胞BmN贴壁培养 | 第60页 |
| 2.5.2 细胞冻存 | 第60-61页 |
| 2.5.3 细胞复苏 | 第61页 |
| 2.6 重组病毒vBmpolh-BmSNMP的构建及鉴定 | 第61-62页 |
| 2.6.1 重组病毒基因组通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞 | 第61-62页 |
| 2.6.2 重组病毒vBmpolh-BmSNMP鉴定 | 第62页 |
| 2.7 目的蛋白Polh-BmSNMP在家蚕BmN细胞中的表达 | 第62页 |
| 2.8 Western blotting鉴定蛋白表达 | 第62页 |
| 2.9 MTT检测细胞活力 | 第62-63页 |
| 2.10 流式细胞仪检测 | 第63页 |
| 2.11 重组载体pFastBac HTb-polh-BmSNMP-EGFP的构建 | 第63-64页 |
| 2.11.1 EGFP基因的PCR扩增 | 第63-64页 |
| 2.11.2 纯化回收的EGFP和重组质粒pFastBac HTb-polh-BmSNMP的双酶切 | 第64页 |
| 2.12 重组病毒vBmpolh-BmSNMP-EGFP的构建及荧光观察 | 第64页 |
| 3 结果 | 第64-71页 |
| 3.1 重组质粒pFastBac HTb-polh-BmSNMP的筛选和鉴定 | 第64-65页 |
| 3.2 重组Bacmid PCR鉴定 | 第65-66页 |
| 3.3 重组病毒vBmpolh-BmSNMP的PCR鉴定 | 第66页 |
| 3.4 Polh-BmSNMP蛋白在家蚕细胞中表达的Western blotting鉴定 | 第66-67页 |
| 3.5 MTT检测结果分析 | 第67-68页 |
| 3.6 流式细胞仪检测 | 第68-69页 |
| 3.7 PCR扩增基因片段EGFP | 第69页 |
| 3.8 重组载体pFastBac HTb-polh-BmSNMP-EGFP鉴定 | 第69-70页 |
| 3.9 荧光显微镜下观察细胞内的荧光 | 第70-71页 |
| 4 讨论 | 第71-73页 |
| 第七章 BmSNMP基因的转录水平分析 | 第73-78页 |
| 1 材料与试剂 | 第73页 |
| 1.1 材料 | 第73页 |
| 1.2 试剂及仪器 | 第73页 |
| 2 方法 | 第73-75页 |
| 2.1 家蚕组织总RNA的提取和cDNA的合成 | 第73页 |
| 2.2 荧光定量PCR引物的设计 | 第73-74页 |
| 2.3 荧光定量PCR | 第74页 |
| 2.4 荧光定量PCR数据分析 | 第74-75页 |
| 3 结果 | 第75-77页 |
| 3.1 家蚕五龄幼虫各组织中BmSNMP mRNA量的变化 | 第75-77页 |
| 4 讨论 | 第77-78页 |
| 第八章 RNA干扰试验 | 第78-85页 |
| 1 试剂和材料 | 第78页 |
| 1.1 材料与设备 | 第78页 |
| 1.2 试剂 | 第78页 |
| 2 方法 | 第78-81页 |
| 2.1 dsRNA的合成 | 第78-80页 |
| 2.1.1 合成体外转录模板 | 第78-79页 |
| 2.1.2 体外转录RNA | 第79-80页 |
| 2.1.3 dsRNA浓度的测定 | 第80页 |
| 2.2 RNAi----dsRNA的转染 | 第80页 |
| 2.3 MTT检测细胞活力 | 第80-81页 |
| 2.4 流式细胞仪检测 | 第81页 |
| 3 结果 | 第81-83页 |
| 3.1 dsRNA的合成 | 第81-82页 |
| 3.2 BmSNMP RNAi的MTT检测结果分析 | 第82页 |
| 3.3 流式细胞仪检测 | 第82-83页 |
| 4 讨论 | 第83-85页 |
| 结论 | 第85-86页 |
| 参考文献 | 第86-90页 |
| 致谢 | 第90页 |
