论文目录 | |
| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-12页 |
| 缩略语 | 第12-13页 |
| 第一部分 文献综述与实验设计 | 第13-22页 |
| 第一章 文章综述 | 第14-20页 |
| 1 膜蛋白研究 | 第14-16页 |
| 1.1 膜蛋白 | 第14页 |
| 1.2 膜蛋白研究的意义 | 第14-15页 |
| 1.3 膜蛋白研究的现状 | 第15-16页 |
| 2 Ocular alb超家族 | 第16-17页 |
| 2.1 Ocular alb与GPCR | 第16页 |
| 2.2 OA1生物学作用 | 第16-17页 |
| 2.3 OA1及眼白化病Ⅰ型的研究进展 | 第17页 |
| 3. 家蚕杆状病毒表达系统及多角体融合表达 | 第17-20页 |
| 3.1 家蚕生物反应器 | 第17-18页 |
| 3.2 家蚕核型多角体病毒 | 第18页 |
| 3.3 家蚕Bac-to-Bac表达系统 | 第18页 |
| 3.4 多角体融合表达的研究及应用 | 第18-20页 |
| 第二章 实验设计方案 | 第20-22页 |
| 1 实验目的和意义 | 第20页 |
| 2 研究内容 | 第20-21页 |
| 3 实验流程和实验技术 | 第21-22页 |
| 第二部分 研究论文 | 第22-68页 |
| 第三章 生物信息学分析 | 第23-30页 |
| 1 生物信息学工具和软件 | 第23页 |
| 2 方法 | 第23页 |
| 3 结果 | 第23-29页 |
| 3.1 基因序列的比对 | 第23-24页 |
| 3.2 疏水性分析 | 第24-25页 |
| 3.3 跨膜分析 | 第25-26页 |
| 3.4 信号肽分析 | 第26页 |
| 3.5 定位分析 | 第26-27页 |
| 3.6 高级结构预测 | 第27页 |
| 3.7 BmOA基因氨基酸序列的同源性分析 | 第27-28页 |
| 3.8 BmOA基因进化树的构建 | 第28-29页 |
| 4 讨论 | 第29-30页 |
| 第四章 原核表达及蛋白纯化 | 第30-44页 |
| 1 材料与试剂 | 第30-32页 |
| 1.1 材料 | 第30页 |
| 1.2 试剂 | 第30页 |
| 1.3 主要试剂的配制 | 第30-32页 |
| 1.3.1 碱法小量制备质粒用试剂 | 第30-31页 |
| 1.3.2 SDS-PAGE电泳用试剂 | 第31页 |
| 1.3.3 纯化用试剂 | 第31页 |
| 1.3.4 Bradford检测用试剂 | 第31页 |
| 1.3.5 Western blotting用试剂 | 第31-32页 |
| 2 方法 | 第32-39页 |
| 2.1 BmOA基因的克隆 | 第32-36页 |
| 2.1.1 PCR获得完整的ORF序列 | 第32-33页 |
| 2.1.2 PCR产物与pBacPAK8-Ph-tev质粒的双酶切反应 | 第33页 |
| 2.1.3 酶切产物的纯化 | 第33-34页 |
| 2.1.4 连接反应 | 第34页 |
| 2.1.5 重组质粒pBacPAK8-Ph-tev-BmOA与表达载体pET-28a的双酶切 | 第34-35页 |
| 2.1.6 酶切产物的纯化 | 第35页 |
| 2.1.7 连接反应 | 第35页 |
| 2.1.8 CaCl2法制备E.coli TG1、BL21(DE3)感受态细胞 | 第35页 |
| 2.1.9 连接产物的转化 | 第35-36页 |
| 2.1.10 重组克隆的筛选与鉴定 | 第36页 |
| 2.2 重组质粒的转化及鉴定 | 第36页 |
| 2.3 重组pET-28a-Ph-tev-BmOA质粒在大肠杆菌中的表达 | 第36-37页 |
| 2.4 SDS-PAGE电泳分析 | 第37页 |
| 2.5 融合蛋白表达产物存在形式的检测分析 | 第37-38页 |
| 2.6 融合蛋白以多角体的特性进行纯化 | 第38-39页 |
| 2.6.1 重组蛋白的大量表达与样品制备 | 第38页 |
| 2.6.2 利用pH改变纯化融合蛋白 | 第38页 |
| 2.6.3 Bradford法检测蛋白浓度 | 第38-39页 |
| 2.6.4 Western blotting检测 | 第39页 |
| 3 结果 | 第39-43页 |
| 3.1 PCR扩增目的基因片段 | 第39-40页 |
| 3.2 重组质粒pBacPAK8-Ph-tev-BmOA的鉴定 | 第40-41页 |
| 3.3 重组质粒pET-28a-Ph-tev-BmOA的鉴定 | 第41页 |
| 3.4 融合蛋白的诱导表达鉴定 | 第41-42页 |
| 3.5 融合蛋白的纯化 | 第42-43页 |
| 4 讨论 | 第43-44页 |
| 第五章 BmOA和polh基因在家蚕杆状病毒表达系统中的融合表达 | 第44-53页 |
| 1 材料与试剂 | 第44-45页 |
| 1.1 材料 | 第44页 |
| 1.2 试剂 | 第44页 |
| 1.3 试剂配制 | 第44-45页 |
| 2 方法 | 第45-50页 |
| 2.1 pUC/M13引物设计 | 第45页 |
| 2.2 重组载体pFastBacHTB-Ph-tev-BmOA的构建 | 第45-46页 |
| 2.3 连接反应 | 第46页 |
| 2.4 重组病毒基因组Bacmid-Ph-tev-BmOA的构建 | 第46-48页 |
| 2.4.1 BmDH10Bac菌感受态的制备 | 第46页 |
| 2.4.2 重组质粒的转化 | 第46-47页 |
| 2.4.3 重组Bacmid的提取 | 第47页 |
| 2.4.4 重组Bacmid PCR鉴定 | 第47-48页 |
| 2.5 细胞培养与冻存、复苏 | 第48-49页 |
| 2.5.1 家蚕细胞BmN贴壁培养 | 第48页 |
| 2.5.2 细胞冻存 | 第48-49页 |
| 2.5.3 细胞复苏 | 第49页 |
| 2.6 重组病毒vBmPh-tev-BmOA的构建及鉴定 | 第49-50页 |
| 2.6.1 重组病毒基因组通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞 | 第49页 |
| 2.6.2 重组病毒vBmPh-tev-BmOA鉴定 | 第49-50页 |
| 2.7 目的蛋白Ph-tev-BmOA在家蚕BmN细胞中的表达 | 第50页 |
| 3 结果 | 第50-52页 |
| 3.1 重组载体pFastBacHTB-Ph-tev-BmOA鉴定结果 | 第50-51页 |
| 3.2 重组病毒DNA vBmPh-tev-BmOA鉴定鉴定结果 | 第51页 |
| 3.3 目的蛋白Ph-tev-BmOA在家蚕BmN细胞中的表达 | 第51-52页 |
| 4 讨论 | 第52-53页 |
| 第六章 BmOA在五龄家蚕各组织中的表达分布 | 第53-60页 |
| 1 材料与试剂 | 第53页 |
| 1.1 材料 | 第53页 |
| 2 方法 | 第53-55页 |
| 2.1 总RNA的提取 | 第53页 |
| 2.2 引物设计 | 第53-54页 |
| 2.3 cDNA的合成 | 第54页 |
| 2.4 荧光定量PCR反应程序 | 第54-55页 |
| 2.5 荧光定量PCR数据分析 | 第55页 |
| 3 结果 | 第55-58页 |
| 3.1 荧光定量PCR扩增曲线与熔解曲线 | 第55-57页 |
| 3.2 五龄幼虫各组织荧光定量PCR产物电泳检测 | 第57页 |
| 3.3 家蚕五龄幼虫各组织中BmOA基因的荧光定量PCR数据结果 | 第57-58页 |
| 4 讨论 | 第58-60页 |
| 第七章 BmOA基因的RNAi对家蚕培养细胞生物活性的影响 | 第60-68页 |
| 1 材料与试剂 | 第60页 |
| 1.1 材料 | 第60页 |
| 1.2 试剂 | 第60页 |
| 1.3 试剂的配制 | 第60页 |
| 2 方法 | 第60-63页 |
| 2.1 dsRNA的合成 | 第60-62页 |
| 2.1.1 合成体外转录模板 | 第61页 |
| 2.1.2 体外转录RNA | 第61-62页 |
| 2.1.3 dsRNA浓度的测定 | 第62页 |
| 2.2 RNAi-dsRNA的转染 | 第62页 |
| 2.3 MTT检测细胞活力 | 第62-63页 |
| 2.4 流式细胞仪检测 | 第63页 |
| 3 结果 | 第63-67页 |
| 3.1 dsRNA的合成 | 第63-64页 |
| 3.2 BmOA RNAi的MTT检测结果分析 | 第64-65页 |
| 3.3 流式细胞仪检测 | 第65-67页 |
| 4 讨论 | 第67-68页 |
| 结论 | 第68-69页 |
| 参考文献 | 第69-73页 |
| 致谢 | 第73页 |
