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矮沙冬青抗冻蛋白基因(AnAFP)功能验证

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矮沙冬青抗冻蛋白基因(AnAFP)功能验证
论文目录
 
摘要第1-7页
Abstract第7-13页
1 文献综述第13-17页
  1.1 植物抗冻蛋白及其编码基因第13-14页
    1.1.1 植物抗冻蛋白第13-14页
    1.1.2 植物抗冻蛋白基因的克隆与功能验证第14页
  1.2 矮沙冬青第14-16页
    1.2.1 沙冬青的种类及分布第14-15页
    1.2.2 矮沙冬青生物学特性第15页
    1.2.3 沙冬青抗冻蛋白及其编码基因第15-16页
  1.3 本研究的目的和意义第16-17页
2 材料和方法第17-36页
  2.1 技术路线第17页
  2.2 实验方法第17-36页
    2.2.1 推导的AnAFP蛋白的生物信息学分析第17-18页
    2.2.2 AnAFP基因开放阅读框的克隆第18-20页
      2.2.2.1 引物设计第18页
      2.2.2.2 CTAB法提取基因组DNA第18页
      2.2.2.3 PCR扩增反应及胶回收第18-19页
      2.2.2.4 回收产物加多聚腺苷化反应第19页
      2.2.2.5 连接PMD19-T载体第19页
      2.2.2.6 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞第19-20页
    2.2.3 构建pET-32a-AnAFP原核表达载体第20-22页
      2.2.3.1 引物设计及PCR扩增第21页
      2.2.3.2 双酶切PCR回收产物与pET-32a载体第21-22页
      2.2.3.3 连接、转化与筛选第22页
    2.2.4 目的蛋白诱导表达第22-24页
      2.2.4.1 试剂配制第22-23页
      2.2.4.2 IPTG诱导AnAFP蛋白表达及SDS-PAGE电泳检测第23页
      2.2.4.3 低温条件下大肠杆菌存活率的测定第23-24页
    2.2.5 构建pRI201-GUS-AnAFP植物表达载体第24-27页
      2.2.5.1 构建中间载体pRI201-AnAFP第25-26页
        2.2.5.1.1 引物设计及PCR扩增第25页
        2.2.5.1.2 双酶切PCR回收产物和pRI201-GUS载体第25-26页
        2.2.5.1.3 连接,转化与筛选第26页
      2.2.5.2 通过中间载体构建pRI201-GUS-AnAFP第26-27页
        2.2.5.2.1 引物设计及PCR扩增第26-27页
        2.2.5.2.2 双酶切PCR回收产物和pRI201-GUS载体第27页
        2.2.5.2.3 连接,转化与筛选第27页
    2.2.6 农杆菌介导的植物表达载体pRI201-GUS-AnAFP转化烟草第27-32页
      2.2.6.1 植物培养基第27-28页
      2.2.6.2 农杆菌菌液的制备第28页
      2.2.6.3 农杆菌介导的烟草转化第28-29页
      2.2.6.4 转基因植株的检测第29-32页
        2.2.6.4.1 再生植株的PCR检测第29页
        2.2.6.4.2 阳性苗叶片的GUS染色第29-30页
        2.2.6.4.3 转基因T_1代株系Southern杂交检测第30-32页
    2.2.7 荧光定量PCR检测AnAFP表达量第32-34页
      2.2.7.1 材料处理和总RNA提取第32-33页
      2.2.7.2 RNA反转录成cDNA第33页
      2.2.7.3 荧光定量PCR第33-34页
    2.2.8 转基因烟草的抗寒性检测第34-36页
      2.2.8.1 低温胁迫条件下转基因烟草的相对电导率的测定第34-35页
      2.2.8.2 低温胁迫处理后转基因烟草和野生型烟草的表型观察第35-36页
3 结果与分析第36-52页
  3.1 推导的AnAFP蛋白的生物信息学分析结果第36-37页
  3.2 矮沙冬青抗冻蛋白基因ORF第37-38页
    3.2.1 矮沙冬青抗冻蛋白基因ORF的PCR扩增产物第37页
    3.2.2 重组菌落的PCR鉴定第37-38页
    3.2.3 阳性克隆的测序结果第38页
  3.3 构建pET32a-AnAFP原核表达载体结果第38-39页
    3.3.1 酶切位点的添加第38页
    3.3.2 重组子pET32a-AnAFP的鉴定第38-39页
  3.4 融合蛋白的诱导表达第39-40页
  3.5 低温条件下大肠杆菌存活率的测定第40-42页
  3.6 构建植物表达载体pRI201-GUS-AnAFP第42-44页
    3.6.1 构建中间载体pRI201-AnAFP第42-43页
      3.6.1.1 酶切位点的添加第42页
      3.6.1.2 鉴定中间载体pRI201-AnAFP第42-43页
    3.6.2 通过中间载体pRI201-AnAFP构建表达载体pRI201-GUS-AnAFP第43-44页
  3.7 农杆菌介导的植物表达载体pRI201-GUS-AnAFP转化烟草第44-48页
    3.7.1 农杆菌介导的烟草转化第44-45页
    3.7.2 转基因植株的检测第45-48页
      3.7.2.1 T_0代转基因烟草的PCR检测第45-46页
      3.7.2.2 T_0代转基因烟草的GUS染色第46页
      3.7.2.3 T_1代转基因烟草的PCR鉴定第46页
      3.7.2.4 T_1代转基因烟草的GUS染色第46-47页
      3.7.2.5 转基因T_1代株系基因组DNA Southern杂交检测第47页
      3.7.2.6 T_2代株系检测第47-48页
  3.8 AnAFP基因在低温胁迫下的表达第48-50页
    3.8.1 内参基因EF1-α和AnAFP基因的引物特异性第48-49页
    3.8.2 内参基因EF1-α和AnAFP基因的标准曲线第49页
    3.8.3 AnAFP基因在低温胁迫下的表达模式第49-50页
  3.9 转基因烟草抗寒性检测第50-52页
    3.9.1 低温处理下相对电导率的测定结果第50页
    3.9.2 低温处理后植株的表型鉴定第50-52页
4 讨论第52-54页
  4.1 大肠杆菌异源表达系统第52页
  4.2 pET-32a质粒表达对宿主菌的影响第52页
  4.3 AnAFP基因异源表达受低温胁迫的影响第52-53页
  4.4 AnAFP的耐寒性机制第53页
  4.5 展望第53-54页
参考文献第54-61页
致谢第61-62页
攻读硕士学位期间发表论文第62页

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