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谷胱甘肽双功能合成酶的克隆表达、酶学性质及其应用的研究

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谷胱甘肽双功能合成酶的克隆表达、酶学性质及其应用的研究
论文目录
 
致谢第1-6页
摘要第6-8页
ABSTRACT第8-15页
第一章 绪论第15-27页
  1.1 谷胱甘肽的性质及其主要应用第15-16页
  1.2 谷胱甘肽的生物合成及其代谢第16-17页
    1.2.1 谷胱甘肽的生物合成第16-17页
    1.2.2 谷胱甘肽的代谢第17页
  1.3 谷胱甘肽的主要生产方法第17-19页
    1.3.1 溶剂萃取法第17-18页
    1.3.2 化学合成法第18页
    1.3.3 发酵法第18页
    1.3.4 酶法第18-19页
  1.4 谷胱甘肽双功能酶GSHF第19-21页
    1.4.1 简介第19页
    1.4.2 谷胱甘肽双功能酶的研究背景第19-21页
    1.4.3 谷胱甘肽双功能酶的结构第21页
  1.5 ATP再生体系第21-23页
    1.5.1 简介第21-22页
    1.5.2 多聚磷酸激酶PPK第22-23页
  1.6 大肠杆菌重组表达系统第23-26页
    1.6.1 可溶表达策略第23-25页
    1.6.2 大肠杆菌的高密度发酵第25-26页
  1.7 本论文的研究内容与目的第26-27页
第二章 材料与方法第27-36页
  2.1 菌株与质粒第27-28页
  2.2 仪器与试剂第28-30页
    2.2.1 主要仪器第28-29页
    2.2.2 工具酶与主要试剂第29-30页
  2.3 培养基第30页
  2.4 分子生物学相关操作第30-32页
    2.4.1 分子克隆相关实验第30-31页
    2.4.2 大肠杆菌菌浓测定第31页
    2.4.3 大肠杆菌细胞超声破碎第31-32页
    2.4.4 蛋白浓度测定第32页
    2.4.5 SDS-PAGE蛋白电泳第32页
  2.5 谷胱甘肽双功能酶GsHF的酶活测定第32-33页
    2.5.1 谷胱甘肽的酶催化合成第32-33页
    2.5.2 谷胱甘肽的检测第33页
  2.6 ATP、ADP、AMP的高效液相色谱(HPLC)分析第33-36页
第三章 谷胱甘肽双功能酶在大肠杆菌中的重组表达与优化第36-45页
  3.1 引言第36页
  3.2 实验材料第36-37页
    3.2.1 菌株与质粒第36-37页
    3.2.2 工具酶和主要试剂第37页
    3.2.3 培养基与培养条件第37页
  3.3 实验方法第37-39页
    3.3.1 引物设计第37页
    3.3.2 谷胱甘肽双功能酶基因片段的获得第37页
    3.3.3 pET28a(+)-GshF表达载体的构建第37-38页
    3.3.4 谷胱甘肽双功能酶GshF的重组表达第38页
    3.3.5 GshF的表达条件的优化第38-39页
  3.4 结果与讨论第39-43页
    3.4.1 谷胱甘肽双功能酶基因的克隆第39页
    3.4.2 pET28a(+)-GshF高效表达载体构建及其双酶切验证第39-40页
    3.4.3 重组蛋白GshF的表达第40-41页
    3.4.4 诱导条件对GshF表达的影响第41-43页
  3.5 小结第43-45页
第四章 谷胱甘肽双功能酶GSHF的纯化与酶学性质的研究第45-54页
  4.1 引言第45页
  4.2 实验材料第45-46页
    4.2.1 菌株与质粒第45页
    4.2.2 主要试剂与设备第45-46页
    4.2.3 培养基与培养条件第46页
  4.3 实验方法第46-48页
    4.3.1 发酵液的处理第46页
    4.3.2 蛋白纯化第46-47页
    4.3.3 脱盐第47页
    4.3.4 蛋白浓度测定与酶活测定第47页
    4.3.5 谷胱甘肽双功能酶GshF的酶学性质分析第47-48页
    4.3.6 利用GshF体外催化合成谷胱甘肽第48页
  4.4 结果与讨论第48-52页
    4.4.1 蛋白纯化第48-49页
    4.4.2 酶学性质分析第49-52页
    4.4.3 利用GshF体外催化合成谷胱甘肽第52页
  4.5 小结第52-54页
第五章 以甘油为碳源产GSHF的放大培养第54-59页
  5.1 引言第54页
  5.2 材料与方法第54-57页
    5.2.1 表达菌株第54页
    5.2.2 主要设备第54页
    5.2.3 培养基第54-55页
    5.2.4 培养方法第55-56页
    5.2.5 甘油浓度测定第56-57页
  5.3 结果与讨论第57-58页
  5.4 小结第58-59页
第六章 大肠杆菌来源重组聚磷酸激酶PPK用于再生ATP合成谷胱甘肽第59-68页
  6.1 引言第59页
  6.2 实验材料第59-60页
    6.2.1 菌株与质粒第59页
    6.2.2 主要试剂与设备第59页
    6.2.3 培养基与培养条件第59-60页
  6.3 实验方法第60-61页
    6.3.1 大肠杆菌ppk基因的获得第60页
    6.3.2 pET28a(+)-PPK表达质粒的构建第60页
    6.3.3 PPK的表达纯化第60页
    6.3.4 PPK的亲和纯化第60页
    6.3.5 PPK的酶活测定第60-61页
    6.3.6 PPK与GshF相偶联用于谷胱甘肽的合成第61页
  6.4 结果与讨论第61-67页
    6.4.1 大肠杆菌ppk的克隆第61-62页
    6.4.2 pET28a (+)-ppk表达质粒的构建及酶切验证第62页
    6.4.3 多聚磷酸激酶PPK的表达第62-63页
    6.4.4 多聚磷酸激酶PPK亲和纯化第63-64页
    6.4.5 多聚磷酸激酶PPK的酶活测定第64-66页
    6.4.6 PPK与GshF偶联用于合成谷胱甘肽第66-67页
  6.5 小结第67-68页
第七章 结论与展望第68-70页
  7.1 结论第68-69页
  7.2 展望第69-70页
参考文献第70-77页
作者简介第77页

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