论文目录 | |
| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-10页 |
| 1 前言 | 第10-17页 |
| 1.1 香蕉枯萎病及其危害 | 第10-11页 |
| 1.2 microRNA的研究进展 | 第11-14页 |
| 1.2.1 miRNA的发现 | 第11页 |
| 1.2.2 miRNA的起源与生物合成 | 第11-13页 |
| 1.2.3 miRNA的特征 | 第13页 |
| 1.2.4 miRNA的调控机理 | 第13页 |
| 1.2.5 miRNA的生物学功能 | 第13-14页 |
| 1.3 miRNA的研究方法 | 第14-15页 |
| 1.4 本研究目的、意义与技术路线 | 第15-17页 |
| 1.4.1 本研究的目的与意义 | 第15页 |
| 1.4.2 本研究的技术路线 | 第15-17页 |
| 2 材料与方法 | 第17-34页 |
| 2.1 实验材料、菌株 | 第17页 |
| 2.2 实验仪器与试剂 | 第17-20页 |
| 2.2.1 主要仪器 | 第17-18页 |
| 2.2.2 培养基及试剂 | 第18-19页 |
| 2.2.3 分子克隆与试剂盒 | 第19-20页 |
| 2.3 香蕉枯萎病病菌离体叶片接种与取样 | 第20页 |
| 2.3.1 香蕉枯萎病尖孢镰刀菌菌株的活化与培养 | 第20页 |
| 2.3.2 香蕉枯萎病病原菌的接种与取样 | 第20页 |
| 2.4 香蕉miRNA与降解组的高通量测序 | 第20-22页 |
| 2.5 小RNA测序结果的生物信息学分析 | 第22页 |
| 2.6 降解组测序结果的生物信息学分析 | 第22-23页 |
| 2.7 香蕉叶片总DNA的提取 | 第23-24页 |
| 2.8 香蕉叶片总RNA的提取 | 第24页 |
| 2.9 实时荧光定量PCR | 第24-28页 |
| 2.9.1 miRNA引物的设计 | 第24-26页 |
| 2.9.2 cDNA第一链的合成 | 第26-27页 |
| 2.9.3 qRT-PCR检测miRNA的表达量 | 第27-28页 |
| 2.10 与病理相关miRNA的克隆 | 第28-31页 |
| 2.10.1 克隆引物的设计 | 第28-29页 |
| 2.10.2 目的基因的克隆 | 第29页 |
| 2.10.3 PCR扩增产物的回收 | 第29-30页 |
| 2.10.4 PCR扩增产物的连接 | 第30页 |
| 2.10.5 重组质粒的遗传转化 | 第30页 |
| 2.10.6 阳性克隆检测 | 第30页 |
| 2.10.7 目的基因的测序及生物信息学分析 | 第30-31页 |
| 2.11 植物表达载体的构建 | 第31-34页 |
| 2.11.1 pCAMBIA 3301质粒的提取 | 第31页 |
| 2.11.2 pEASY-T3-miRNA质粒的提取 | 第31页 |
| 2.11.3 质粒的双酶切 | 第31-32页 |
| 2.11.4 目的片段的回收 | 第32页 |
| 2.11.5 pCAMBIA3301载体骨架和miRNA前体基因的连接 | 第32页 |
| 2.11.6 热激法转化大肠杆菌(E.coli)感受态细胞 | 第32页 |
| 2.11.7 酶切验证 | 第32-33页 |
| 2.11.8 农杆菌(LBA4404)感受态细胞的制备 | 第33页 |
| 2.11.9 冻融法转化农杆菌(LBA4404)感受态细胞 | 第33页 |
| 2.11.10 菌种保存 | 第33-34页 |
| 3 结果与分析 | 第34-80页 |
| 3.1 香蕉枯萎病接种的结果 | 第34页 |
| 3.2 miRNA测序结果分析 | 第34-54页 |
| 3.2.1 数据质量及长度分布 | 第34-36页 |
| 3.2.2 与香蕉基因组比对 | 第36-38页 |
| 3.2.3 Genbank数据库比对 | 第38-39页 |
| 3.2.4 Rfam数据库比对 | 第39页 |
| 3.2.5 外显子、内含子比对 | 第39-40页 |
| 3.2.6 小RNA的分类注释 | 第40-43页 |
| 3.2.7 已知miRNA表达谱和差异表达分析 | 第43-50页 |
| 3.2.8 候选miRNA的识别、定量及差异表达分析 | 第50-54页 |
| 3.3 降解组测序结果分析 | 第54-66页 |
| 3.3.1 数据质量 | 第54-56页 |
| 3.3.2 与香蕉基因组比对 | 第56-58页 |
| 3.3.3 Genbank数据库比对 | 第58页 |
| 3.3.4 Rfam数据库比对 | 第58-59页 |
| 3.3.5 clean tags的分类注释 | 第59-61页 |
| 3.3.6 miRNA靶基因的鉴定 | 第61-62页 |
| 3.3.7 GO功能注释 | 第62-64页 |
| 3.3.8 KEGG通路分析 | 第64-66页 |
| 3.4 综合小RNA测序和降解组测序信息 | 第66-72页 |
| 3.5 香蕉总DNA和总RNA质量分析 | 第72-73页 |
| 3.6 qRT-PCR验证测序报告结果 | 第73-77页 |
| 3.7 差异表达miRNA前体基因表达载体的PCR鉴定 | 第77-78页 |
| 3.8 预测miRNA前体基因所形成的茎环结构 | 第78-80页 |
| 4 讨论 | 第80-83页 |
| 4.1 香蕉叶片总RNA提取质量的探索 | 第80页 |
| 4.2 茎环法和加尾法的比较 | 第80-81页 |
| 4.3 实时荧光定量PCR体系的探索 | 第81页 |
| 4.4 高通量测序的运用 | 第81-82页 |
| 4.5 本研究后续工作 | 第82-83页 |
| 5 结论 | 第83-84页 |
| 参考文献 | 第84-89页 |
| 附录 | 第89-128页 |
| 附录一 已知miRNA的表达谱 | 第89-117页 |
| 附录二 候选miRNA的表达谱 | 第117-128页 |
| 致谢 | 第128页 |
