论文目录 | |
| 摘要 | 第1-9页 |
| ABSTRACT | 第9-11页 |
| 缩略词表 | 第11-12页 |
| 1 前言 | 第12-20页 |
| 1.1 赤霉病研究概况 | 第12-13页 |
| 1.1.1 赤霉病的分布及危害 | 第12页 |
| 1.1.2 禾谷镰刀菌的分类 | 第12-13页 |
| 1.1.3 禾谷镰刀菌致病机理 | 第13页 |
| 1.2 小麦及其转基因研究 | 第13-14页 |
| 1.3 几丁质合成酶(CHS)的结构和功能 | 第14-15页 |
| 1.3.1 几丁质合成酶的结构 | 第14-15页 |
| 1.3.2 几丁质合成酶的功能 | 第15页 |
| 1.4 RNAi研究进展 | 第15-18页 |
| 1.4.1 RNAi技术的发现 | 第15-16页 |
| 1.4.2 RNAi的作用机理及特点 | 第16-18页 |
| 1.4.3. RNAi与植物抗病研究 | 第17-18页 |
| 1.5 离体叶片接种研究进展 | 第18-19页 |
| 1.6 研究目的和意义 | 第19-20页 |
| 2 材料与方法 | 第20-30页 |
| 2.1 实验材料 | 第20-22页 |
| 2.1.1 菌株及质粒 | 第20页 |
| 2.1.2 酶和试剂 | 第20-21页 |
| 2.1.2.1 酶与试剂盒 | 第20页 |
| 2.1.2.2 培养基 | 第20-21页 |
| 2.1.2.3 DNA提取试剂 | 第21页 |
| 2.1.3 拟南芥 | 第21页 |
| 2.1.4 实验主要仪器设备 | 第21-22页 |
| 2.2 实验方法 | 第22-30页 |
| 2.2.0 菌株的活化 | 第22页 |
| 2.2.1 孢子的收集 | 第22页 |
| 2.2.2 拟南芥(Arabidopsis thaliana) | 第22-24页 |
| 2.2.2.1 拟南芥的种植 | 第22-23页 |
| 2.2.2.2 农杆菌介导的拟南芥转化 | 第23页 |
| 2.2.2.3 拟南芥叶片DNA的提取 | 第23-24页 |
| 2.2.2.4 转基因拟南芥PCR鉴定 | 第24页 |
| 2.2.2.5 拟南芥离体叶片接种孢子B51066 | 第24页 |
| 2.2.3 转基因拟南芥RT-PCR鉴定 | 第24-26页 |
| 2.2.3.1 总RNA提取 | 第24-25页 |
| 2.2.3.2 RNA中基因组DNA的去除 | 第25页 |
| 2.2.3.3 RNA逆转录为cDNA第一链 | 第25-26页 |
| 2.2.3.4 RT-PCR | 第26页 |
| 2.2.4 DNA片段凝胶回收 | 第26-27页 |
| 2.2.5 质粒DNA的提取 | 第27页 |
| 2.2.5.1 试剂盒提取质粒DNA | 第27页 |
| 2.2.5.2 煮沸法提取质粒DNA | 第27页 |
| 2.2.6 PCR扩增 | 第27-28页 |
| 2.2.6.1 Easy Taq酶扩增 | 第27-28页 |
| 2.2.6.2 KOD-Plus高保真酶扩增 | 第28页 |
| 2.2.6.3 农杆菌菌体PCR | 第28页 |
| 2.2.7 T4 DNA连接酶连接目的片段和载体 | 第28页 |
| 2.2.8 感受态细胞制备及转化 | 第28-30页 |
| 2.2.8.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备及转化 | 第28页 |
| 2.2.8.2 农杆菌GV3101感受态细胞的制备及转化 | 第28-29页 |
| 2.2.8.3 大肠杆菌热激转化 | 第29页 |
| 2.2.8.4 农杆菌电击转化 | 第29-30页 |
| 3 结果与分析 | 第30-49页 |
| 3.1 拟南芥抗赤霉病RNAi载体构建 | 第30-32页 |
| 3.1.1 拟南芥抗赤霉病RNAi载体酶切鉴定图谱 | 第31-32页 |
| 3.2 拟南芥多基因克隆中间载体酶切鉴定图谱 | 第32-34页 |
| 3.2.1 拟南芥多基因克隆中间载体构建 | 第32-34页 |
| 3.3 农杆菌转化拟南芥PCR鉴定 | 第34页 |
| 3.4 转基因拟南芥鉴定 | 第34-36页 |
| 3.4.1 T1代转基因拟南芥PCR鉴定 | 第34-35页 |
| 3.4.2 T3代转基因拟南芥PCR鉴定 | 第35-36页 |
| 3.5 转基因拟南芥接种禾谷镰刀菌B51066 | 第36-37页 |
| 3.6 转基因CHS7拟南芥接种B51066后定量PCR(RT-PCR) | 第37-38页 |
| 3.7 小麦单边界RNAi载体构建 | 第38-40页 |
| 3.7.1 小麦单边界载体酶切鉴定图谱 | 第39-40页 |
| 3.7.2 小麦单边界载体农杆菌EHA105转化鉴定 | 第40页 |
| 3.8 小麦双边界RNAi载体构建 | 第40-43页 |
| 3.8.1 小麦双边界载体酶切鉴定图谱 | 第42-43页 |
| 3.9 转基因小麦材料的繁殖与PCR鉴定 | 第43-48页 |
| 3.9.1 转BLF-A6、RNAi-chs7AS3AS4基因T4代小麦的鉴定 | 第43-44页 |
| 3.9.2 转BLF-A6、RNAi-chs7AS3AS4基因T5代小麦的鉴定 | 第44-45页 |
| 3.9.3 转RNAi-pkcAS3-chs3bAS1基因T3代小麦的鉴定 | 第45页 |
| 3.9.4 转RNAi-pkcAS3-chs3bAS1基因T4代小麦的鉴定 | 第45-46页 |
| 3.9.5 转抗菌肽BLF-A6基因T3代小麦的鉴定 | 第46-47页 |
| 3.9.6 转抗菌肽BLF-A6基因T4代小麦的鉴定 | 第47页 |
| 3.9.7 转RNAi-glsAS6-chs3bAS1、RNAi-chs3b-A2S2-A3S3基因T3代小麦鉴定 | 第47-48页 |
| 3.10 转基因小麦材料统计 | 第48-49页 |
| 4 讨论 | 第49-52页 |
| 4.1 决定RNAi效率的因素 | 第49-50页 |
| 4.1.1 RNAi茎环结构的构建 | 第49页 |
| 4.1.2 启动子的选择 | 第49-50页 |
| 4.2 RNAi介导的拟南芥抗赤霉病研究 | 第50页 |
| 4.3 体外离体叶片接种条件的探究 | 第50-52页 |
| 5 参考文献 | 第52-60页 |
| 附录1 构建的拟南芥和小麦表达载体总结列表 | 第60-61页 |
| 附录2 引物 | 第61-62页 |
| 致谢 | 第62页 |
