论文目录 | |
| 符号说明 | 第1-8页 |
| 中文摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 1 前言 | 第12-16页 |
| 1.1 芸薹生链格孢研究进展 | 第12-13页 |
| 1.1.1 芸薹生链格孢生物学性质及危害 | 第12页 |
| 1.1.2 芸薹生链格孢产孢及致病机制 | 第12-13页 |
| 1.2 Abcdm1同源基因的研究 | 第13-14页 |
| 1.3 本研究的意义 | 第14-16页 |
| 2 材料与方法 | 第16-35页 |
| 2.1 试验材料 | 第16-20页 |
| 2.1.1 供试菌株 | 第16页 |
| 2.1.2 质粒 | 第16页 |
| 2.1.3 供试植株 | 第16页 |
| 2.1.4 培养基配置 | 第16-17页 |
| 2.1.5 溶液配置 | 第17-18页 |
| 2.1.6 试验试剂 | 第18页 |
| 2.1.7 仪器与设备 | 第18-19页 |
| 2.1.8 PCR引物 | 第19-20页 |
| 2.2 试验方法 | 第20-35页 |
| 2.2.1 产孢缺陷突变体的筛选 | 第20页 |
| 2.2.2 Hitail-PCR技术扩增插入为点侧翼序列 | 第20-21页 |
| 2.2.3 突变位点的确定 | 第21页 |
| 2.2.4 Abcdm1基因的克隆及序列分析 | 第21-22页 |
| 2.2.5 芸薹生链格孢基因组DNA的提取-CTAB法 | 第22页 |
| 2.2.6 芸薹生链格孢基因组RNA的提取-Trizol法 | 第22-23页 |
| 2.2.7 cDNA的合成 | 第23页 |
| 2.2.8 Abcdm1基因敲除载体构建 | 第23-25页 |
| 2.2.8.1 PCR扩增得到目的片段 | 第23页 |
| 2.2.8.2 Split-markerPCR方法进行片段的连接 | 第23-24页 |
| 2.2.8.3 大肠杆菌的感受态转化 | 第24-25页 |
| 2.2.9 质粒的提取 | 第25-26页 |
| 2.2.10 A+hphA片段和hphB+B片段的大量获取及片段浓缩 | 第26页 |
| 2.2.11 原生质体的转化 | 第26-28页 |
| 2.2.11.1 芸薹生链格孢液体培养 | 第26-27页 |
| 2.2.11.2 原生质体的制备与转化 | 第27-28页 |
| 2.2.12 转化子的验证 | 第28-31页 |
| 2.2.12.1 用潮霉素初步筛选转化子 | 第28-29页 |
| 2.2.12.2 突变体ΔAbcdm1普通PCR验证 | 第29页 |
| 2.2.12.3 Southernblot验证Abcdm1基因缺失转化子 | 第29-31页 |
| 2.2.13 回复突变体C构建过程 | 第31-32页 |
| 2.2.13.1 互补载体C的构建 | 第31-32页 |
| 2.2.13.2 原生质体转化 | 第32页 |
| 2.2.13.3 回复突变体C的筛选及验证 | 第32页 |
| 2.2.14 基因敲除突变体ΔAbcdm1生物学功能分析 | 第32-35页 |
| 2.2.14.1 基因敲除突变体ΔAbcdm1表型观察 | 第32页 |
| 2.2.14.2 突变体生长速率的测定 | 第32-33页 |
| 2.2.14.3 菌丝显微观察 | 第33页 |
| 2.2.14.4 气生菌丝高度测定 | 第33页 |
| 2.2.14.5 突变体渗透胁迫敏感性测定 | 第33页 |
| 2.2.14.6 突变体氧胁迫敏感性测定 | 第33页 |
| 2.2.14.7 突变体致病性观察 | 第33-34页 |
| 2.2.14.8 突变体体外穿透力测定 | 第34页 |
| 2.2.14.9 突变体对碳源的应答反应 | 第34页 |
| 2.2.14.10 突变体对氮源的应答反应 | 第34-35页 |
| 3 结果与分析 | 第35-55页 |
| 3.1 产孢缺陷突变体的筛选 | 第35-36页 |
| 3.2 Hitail-PCR技术确定突变体的插入位点 | 第36-39页 |
| 3.3 Abcdm1基因的克隆及生物学分析 | 第39-41页 |
| 3.3.1 Abcdm1基因的克隆 | 第39页 |
| 3.3.2 Abcdm1基因的生物学分析 | 第39-41页 |
| 3.4 芸薹生链格孢突变体ΔAbcdm1和互补体的构建 | 第41-42页 |
| 3.4.1 芸薹生链格孢ΔAbcdm1突变体的打靶载体的构建 | 第41页 |
| 3.4.2 ΔAbcdm1互补体载体的构建 | 第41-42页 |
| 3.5 芸薹生链格孢突变体ΔAbcdm1的筛选验证 | 第42-43页 |
| 3.5.1 突变体的筛选验证 | 第42-43页 |
| 3.5.1.1 普通PCR筛选验证 | 第42-43页 |
| 3.5.1.2 ΔAbcdm1突变体Southern杂交验证 | 第43页 |
| 3.6 芸薹生链格孢互补体的筛选验证 | 第43-44页 |
| 3.7 芸薹生链格孢突变体ΔAbcdm1的生物学功能分析 | 第44-55页 |
| 3.7.1 突变体菌落表型观察 | 第44-45页 |
| 3.7.2 突变体显微形态观察 | 第45-48页 |
| 3.7.3 菌落生长速率 | 第48-49页 |
| 3.7.4 Abcdm1基因与气生菌丝生长高度的相关性 | 第49-50页 |
| 3.7.5 Abcdm1基因与胁迫应答的相关性 | 第50-51页 |
| 3.7.6 Abcdm1基因与氧胁迫的应答的相关性 | 第51-52页 |
| 3.7.7 Abcdm1基因与营养应答的相关性 | 第52页 |
| 3.7.8 Abcdm1基因与致病性的相关性 | 第52-53页 |
| 3.7.9 Abcdm1基因与体外穿透力的相关性 | 第53-55页 |
| 4 讨论 | 第55-57页 |
| 5 结论 | 第57-58页 |
| 5.1 确定产孢缺陷突变体M85的插入位点 | 第57页 |
| 5.2 成功构建基因缺失突变体ΔAbcdm | 第57页 |
| 5.3 基因缺失突变体ΔAbcdm1的功能研究 | 第57-58页 |
| 参考文献 | 第58-64页 |
| 致谢 | 第64-65页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 | 第65页 |
