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P-Body组件蛋白DCP2、LSm1与PRRSV作用机理初探

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P-Body组件蛋白DCP2、LSm1与PRRSV作用机理初探
论文目录
 
中文摘要第1-10页
Abstract第10-13页
缩略词第13-15页
文献综述第15-23页
第一章 PRRSV N基因的扩增及其编码蛋白高免血清的制备第23-51页
1 器材第23-25页
  1.1 主要材料第23-24页
  1.2 主要试剂第24页
  1.3 主要仪器第24-25页
2 方法第25-38页
  2.1 引物设计第25页
  2.2 Marc145细胞的培养第25-26页
    2.2.1 冻存细胞的复苏与培养第25-26页
    2.2.2 细胞的冻存第26页
  2.3 PRRSV病毒的扩增第26页
  2.4 细胞总RNA的提取第26-27页
  2.5 细胞总RNA的反转录第27页
  2.6 携带PRRSV N基因的原核表达载体的构建第27-31页
    2.6.1 目的片段的PCR扩增第27-28页
    2.6.2 目的片段纯化第28页
    2.6.3 酶切与连接第28-29页
    2.6.4 重组质粒转化第29-30页
    2.6.5 重组质粒的筛选第30-31页
  2.7 PRRSV E11105分离株N蛋白基因的生物信息学分析第31-33页
    2.7.1 参考N基因的毒株信息第31-32页
    2.7.2 PRRSV E11105分离株N基因核苷酸序列相似性比对分析第32页
    2.7.3 PRRSV E11105分离株N基因编码蛋白的氨基酸相似性及比对分析第32页
    2.7.4 PRRSV E11105分离株N基因系统进化树分析第32页
    2.7.5 PRRSV E11105分离株N基因编码的蛋白质二级结构预测第32页
    2.7.6 PRRSV E11105分离株N蛋白B细胞表位预测第32页
    2.7.7 PRRSV E11105分离株N蛋白结构域预测第32-33页
    2.7.8 PRRSV E11105分离株N蛋白跨膜结构预测第33页
    2.7.9 PRRSV E11105分离株N蛋白序列信号肽预测第33页
  2.8 重组蛋白的诱导表达与纯化第33-36页
    2.8.1 重组蛋白诱导表达与鉴定第33-35页
    2.8.2 重组蛋白的纯化与鉴定第35-36页
    2.8.3 蛋白透析第36页
  2.9 高免血清制备第36-37页
    2.9.1 重组蛋白浓度测定第36页
    2.9.2 动物免疫与血清收集第36-37页
  2.10 原核表达蛋白抗原性分析第37-38页
    2.10.1 ELISA分析及效价测定第37页
    2.10.2 高免血清的Western-bloting分析第37-38页
3 结果第38-49页
  3.1 目的基因PCR扩增结果第38页
  3.2 重组质粒的双酶切鉴定结果第38-39页
  3.3 阳性重组质粒pCold I-N的测序结果第39-40页
  3.4 N基因及其编码蛋白的序列分析结果第40-46页
    3.4.1 N基因相似性比对分析结果第40-41页
    3.4.2 N基因系统进化树分析结果第41-42页
    3.4.3 N基因编码蛋白二级结构预测结果第42-43页
    3.4.4 N基因编码蛋白B细胞抗原表位预测结果第43-44页
    3.4.5 N基因编码蛋白的结构域预测结果第44页
    3.4.6 N基因编码蛋白的跨膜结构预测结果第44-45页
    3.4.7 N基因编码蛋白的信号肽预测结果第45-46页
  3.5 重组蛋白的验证第46-47页
    3.5.1 重组蛋白表达形式鉴定结果第46页
    3.5.2 重组表达蛋白的His标签Western blot检测结果第46-47页
  3.6 重组蛋白的纯化结果鉴定第47-48页
  3.7 原核表达的重组蛋白抗原性分析结果第48-49页
    3.7.1 ELISA分析结果第48页
    3.7.2 Western-bloting分析结果第48-49页
4 讨论第49-51页
  4.1 关于PRRSV N蛋白第49-50页
  4.2 关于重组蛋白的可溶性第50-51页
第二章 P-Body组件蛋白DCP2基因的扩增及高免血清的制备第51-77页
1 器材第52页
  1.1 主要材料第52页
  1.2 主要试剂第52页
  1.3 主要仪器第52页
2 方法第52-60页
  2.1 引物设计第53页
  2.2 Marc145细胞的培养第53页
  2.3 细胞总RNA的提取第53页
  2.4 细胞总RNA的反转录第53页
  2.5 DCP2克隆质粒的的构建第53-55页
    2.5.1 目的片段的PCR扩增第53-54页
    2.5.2 目的片段纯化第54页
    2.5.3 目的片段的连接转化第54页
    2.5.4 重组质粒的筛选及序列测定第54-55页
  2.6 Marc145细胞源DCP2基因的生物信息学分析第55-56页
    2.6.1 参考DCP2基因的信息第55页
    2.6.2 Marc145细胞源DCP2基因核苷酸序列相似性比对分析第55-56页
    2.6.3 Marc145细胞源DCP2基因编码蛋白的氨基酸相似性及比对分析第56页
    2.6.4 Marc145细胞源DCP2基因系统进化树分析第56页
    2.6.5 Marc145细胞源DCP2基因编码的蛋白质二级结构预测第56页
    2.6.6 Marc145细胞源DCP2蛋白B细胞表位预测第56页
    2.6.7 Marc145细胞源DCP2蛋白结构域预测第56页
    2.6.8 Marc145细胞源DCP2蛋白跨膜结构预测第56页
    2.6.9 Marc145细胞源DCP2蛋白序列信号肽预测第56页
  2.7 携带Marc145细胞源DCP2基因的原核表达载体的构建第56-58页
    2.7.1 目的片段的PCR扩增第56-57页
    2.7.2 目的片段纯化第57页
    2.7.3 酶切与连接第57-58页
    2.7.4 重组质粒转化第58页
    2.7.5 重组质粒的筛选第58页
  2.8 重组蛋白的诱导表达与纯化第58-60页
    2.8.1 重组蛋白诱导表达与鉴定第58-59页
    2.8.2 重组蛋白的纯化与鉴定第59-60页
    2.8.3 蛋白透析第60页
  2.9 高免血清制备第60页
    2.9.1 重组蛋白浓度测定第60页
    2.9.2 动物免疫与血清收集第60页
  2.10 原核表达蛋白抗原性分析第60页
    2.10.1 ELISA分析及效价测定第60页
    2.10.2 高免血清的Western-bloting分析第60页
3 结果第60-74页
  3.1 目的基因PCR扩增结果第60-61页
  3.2 阳性重组克隆质粒的测序结果第61-64页
  3.4 DCP2基因及其编码蛋白的氨基酸序列分析第64-71页
    3.4.1 Marc145细胞源DCP2 X1、X2亚型氨基酸序列比对结果第64页
    3.4.1 DCP2 X1亚型核酸及氨基酸序列相似性比对分析结果第64-65页
    3.4.2 DCP2 X1亚型基因系统进化树分析结果第65-66页
    3.4.3 DCP2 X1亚型基因编码蛋白二级结构预测结果第66-67页
    3.4.4 DCP2 X1亚型基因编码蛋白B细胞抗原表位预测结果第67-68页
    3.4.5 DCP2 X1亚型基因编码蛋白的结构域预测结果第68-69页
    3.4.6 DCP2 X1亚型基因编码蛋白的跨膜结构预测结果第69页
    3.4.7 DCP2 X1亚型基因编码蛋白的信号肽预测结果第69-70页
    3.4.8 DCP2 X1亚型基因扩增及其重组原核表达质粒的双酶切鉴定结果第70-71页
  3.5 DCP2 X1亚型重组蛋白的验证第71-73页
    3.5.1 DCP2 X1亚型重组蛋白表达形式鉴定结果第71-72页
    3.5.2 DCP2 X1亚型重组表达蛋白的His标签Western blot检测结果第72-73页
  3.6 DCP2 X1亚型重组蛋白的纯化结果鉴定结果第73-74页
  3.7 DCP2 X1亚型原核表达重组蛋白抗原性分析结果第74页
    3.7.1 ELISA分析结果第74页
    3.7.2 Western-bloting分析结果第74页
4 讨论第74-77页
  4.1 关于DCP2蛋白第74-75页
  4.2 关于转录变异体第75-77页
第三章 P-Body组件蛋白LSm1基因的扩增及原核表达质粒的构建第77-93页
1 器材第78-79页
  1.1 主要材料第78页
  1.2 主要试剂第78-79页
  1.3 主要仪器第79页
2 方法第79-84页
  2.1 引物设计第79页
  2.2 Marc145细胞的培养第79页
  2.3 细胞总RNA的提取第79页
  2.4 细胞总RNA的反转录第79页
  2.5 携带Marc145细胞源LSm1基因的原核表达载体的构建第79-82页
    2.5.1 目的片段的巢式PCR扩增第79-80页
    2.5.2 目的片段纯化第80-81页
    2.5.3 酶切与连接第81页
    2.5.4 重组质粒转化第81-82页
    2.5.5 重组质粒的筛选第82页
  2.6 Marc145细胞源LSm1基因的生物信息学分析第82-83页
    2.6.1 参考LSm1基因的信息第82页
    2.6.2 Marc145细胞源LSm1基因核苷酸序列相似性比对分析第82-83页
    2.6.3 Marc145细胞源LSm1基因编码蛋白的氨基酸相似性及比对分析第83页
    2.6.4 Marc145细胞源LSm1基因系统进化树分析第83页
    2.6.5 Marc145细胞源LSm1基因编码的蛋白质二级结构预测第83页
    2.6.6 Marc145细胞源LSm1蛋白B细胞表位预测第83页
    2.6.7 Marc145细胞源LSm1蛋白结构域预测第83页
    2.6.8 Marc145细胞源LSm1蛋白跨膜结构预测第83页
    2.6.9 Marc145细胞源LSm1蛋白序列信号肽预测第83页
  2.7 重组蛋白的诱导表达与纯化第83-84页
    2.7.1 阳性重组质粒转入表达菌BL21第83-84页
    2.7.2 重组蛋白的纯化与鉴定第84页
3 结果第84-91页
  3.0 LSm1的巢式PCR扩增结果第84页
  3.1 重组质粒的双酶切验证第84-85页
  3.2 LSm1的序列测定结果第85页
  3.3 LSm1基因序列的相似性分析结果第85-86页
  3.4 LSm1基因序列编码氨基酸的相似性分析结果第86-87页
  3.5 LSm1基因序列的遗传进化树分析结果第87页
  3.6 LSm1基因编码蛋白二级结构预测结果第87-88页
  3.7 LSm1基因编码蛋白B细胞多参数分析结果第88-89页
  3.8 LSm1基因编码蛋白保守结构域预测结果第89页
  3.9 LSm1基因编码蛋白的跨膜结构预测结果第89-90页
  3.10 LSm1基因编码蛋白信号肽预测结果第90页
  3.11 LSm1重组蛋白的表达及纯化结果鉴定第90-91页
4 讨论第91-93页
  4.1 关于LSm1基因及蛋白第91-92页
  4.2 关于重组蛋白不表达或表达量低的原因第92-93页
第四章 PRRSV复制对宿主LSm1、DCP2基因转录水平的影响第93-102页
1 器材第93-94页
  1.1 主要材料第93页
  1.2 主要试剂第93-94页
  1.3 主要仪器第94页
2 方法第94-96页
  2.1 引物设计第94页
  2.2 Marc145细胞的培养第94-95页
  2.3 PRRSV病毒的扩增第95页
  2.4 病毒TCID50的测定第95页
  2.5 感染病毒不同时间段细胞的收集第95页
  2.6 细胞总RNA的提取第95页
  2.7 反转录第95-96页
  2.8 引物特异性的普通PCR验证第96页
  2.9 不同时间段LSm1、DCP2、N基因转录水平的检测第96页
3 结果第96-100页
  3.1 细胞CPE第96-97页
  3.2 PRRSV TCID_(50)的测定结果第97-98页
  3.3 qPCR引物的普通PCR扩增结果第98页
  3.4 PRRSV对DCP2、LSm1转录水平的影响结果第98-100页
4 讨论第100-102页
  4.1 P-Body对病毒复制的影响第100-101页
  4.2 实时荧光定量PCR技术第101-102页
全文结论第102-103页
参考文献第103-112页
附录一 发表文章第112-113页
附录二 各种培养基、溶液及试剂的配制第113-115页
致谢第115-116页

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