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Rcan2两种剪切变体的表达分布及其在体重调节中作用的研究

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Rcan2两种剪切变体的表达分布及其在体重调节中作用的研究
论文目录
 
摘要第1-11页
Abstract第11-14页
缩写说明第14-16页
1 前言第16-31页
  · 肥胖的流行与危害第16页
  · 体重调节与肥胖发生机制的研究进展第16-22页
    · 体重的影响因素第16-17页
    · 进化思想与“节俭基因”假说第17页
    · “能量稳态”假说与争议第17-20页
    · 肠道菌群与肥胖第20-21页
    · 肥胖研究的其他观点第21-22页
  · Rcan2基因与体重调节第22-26页
    · Rcan2基因的发现与简介第22-24页
    · Rcan2基因的功能第24-26页
      · Rcan2~(-/-)小鼠模型第24页
      · Rcan2在体重调节和肥胖发生中的功能研究第24-26页
  · CRISPR/Cas9与基因组编辑第26-29页
    · 基因组编辑技术的沿革第26-27页
    · CRISPR/Cas系统第27-28页
    · CRISPR/Cas9系统的改造与基因组编辑第28-29页
  · Tol2转座子系统与转基因动物模型的建立第29-31页
    · Tol2转座子简介第29-30页
    · Tol2转座子系统的改造及其在转基因动物模型中的应用第30-31页
2 实验动物、试剂与仪器第31-40页
  · 实验动物第31页
  · 实验所需试剂第31-37页
    · 主要试剂及其配制方法第31-35页
    · 其他试剂第35-37页
  · 实验耗材与仪器第37-40页
    · 动物饲料第37页
    · 实验耗材第37页
    · 主要实验仪器第37-40页
3 实验方法第40-68页
  · 实验小鼠基因型的鉴定第40-41页
    · 小鼠基因组粗提第40页
    · PCR鉴定小鼠的基因型第40-41页
  · CRISPR/Cas9系统介导的Rcan2-1敲除小鼠(Rcan2-1~(-/-))和Rcan2-3敲除小鼠(Rcan2-3~(-/-))的制作第41-54页
    · Rcan2-1敲除(Rcan2-1~(-/-))和Rcan2-3敲除(Rcan2-3~(-/-))的靶点设计第41-42页
    · 构建携带靶点序列的pX330打靶载体第42-47页
      · 携带BbsI粘性末端的靶点序列的设计与合成第42-43页
      · 退火合成携带BbsI粘性末端的双链靶点序列第43页
      · pX330质粒的BbsI酶切第43页
      · pX330质粒的BbsI酶切产物的胶回收第43-44页
      · pX330载体骨架与靶点序列的连接反应第44-45页
      · 连接产物的转化第45页
      · 阳性克隆的初筛和测序第45-46页
      · 阳性克隆的扩大培养、甘油保菌和质粒提取第46-47页
    · 构建靶点验证载体第47-49页
      · 靶点验证片段的扩增和胶回收第47页
      · 靶点验证序列连入pGEM-Teasy载体第47-48页
      · 靶点验证序列连入pCAG-EGxxFP质粒第48-49页
    · 在细胞水平上验证靶点突变效率第49页
      · HEK293T细胞的培养第49页
      · 靶点验证质粒与pX330打靶载体质粒共转HEK293T细胞第49页
    · 体外转录Cas9 RNA和gRNA第49-53页
      · 体外转录Cas9 RNA第50-52页
        · Cas9 RNA体外转录模板的制备与纯化第50-51页
        · 体外转录Cas9 RNA第51-52页
      · 体外转录Rcan2-1、Rcan2-3特异的gRNA第52-53页
        · gRNA体外转录模板的制备与纯化第52页
        · 体外转录gRNA第52-53页
    · 打靶载体的显微注射第53页
      · 受精卵和显微注射用核酸的准备第53页
      · 显微注射第53页
    · 阳性小鼠的筛选和纯合突变小鼠的获得第53-54页
      · 阳性小鼠的筛选第53页
      · 纯合小鼠的获得第53-54页
  · CRISPR/Cas9系统介导的Rcan2-1~(LacZ)、Rcan2-3~(LacZ)小鼠的制作第54页
  · Tol2转座子系统介导的Rcan2-1~(FLAG)、Rcan2-3~(FLAG)小鼠的制作第54-62页
    · 小鼠脑RNA的提取第54-55页
    · 小鼠脑cDNA的制备第55页
    · Rcan2-1/FLAG序列扩增与纯化、pGEM-Teasy+Rcan2-1/FLAG载体的构建第55-56页
    · 转基因载体pRP (Exp)-EF1α>Rcan2-1/FLAG的构建第56-57页
    · Rcan2-1/FLAG的启动子替换(EF1a→CMV)第57-58页
    · Rcan2-1/FLAG转基因载体的改造第58-59页
    · Rcan2-3/FLAG的启动子替换(EF1α→CMV)第59-60页
    · Rcan2-1/FLAG、Rcan2-3/FLAG体外表达检测第60页
    · Rcan2-1/FLAG、Rcan2-3/FLAG转入To12转座子系统第60-61页
    · 体外转录转座酶(TPase) RNA第61页
    · 质粒pTol2-CMV>Rcan2-1/FLAG、pTol2-CMV >Rcan2-3/FLAG的纯化第61页
    · 显微注射与转基因小鼠的鉴定第61-62页
  · 体重监测实验第62页
  · 小鼠体重、组织重量、体长等指标的测定第62页
  · 小鼠组织蛋白的提取第62-63页
  · Western blot检测目的蛋白的表达情况第63页
  · 小鼠组织RNA提取、反转录与实时荧光定量PCR第63-64页
    · 小鼠组织RNA的提取、反转录获得cDNA第63-64页
    · 实时荧光定量PCR第64页
  · 小鼠组织RT-PCR实验第64-65页
    · 小鼠组织RNA的提取、反转录获得cDNA第64页
    · RT-PCR检测目的基因的表达情况第64-65页
  · 小鼠组织的石蜡切片与苏木精-伊红染色(H&E染色)第65-66页
    · 小鼠组织的石蜡切片第65页
    · 石蜡切片的苏木精-伊红染色(H&E染色)第65-66页
  · 小鼠胚胎、脑、脊髓的X-Gal染色第66-67页
    · 小鼠胚胎的X-Gal染色第66页
    · 小鼠脑、脊髓的X-Gal染色第66-67页
  · 统计学分析第67-68页
4 实验结果第68-95页
  · CRISPR/Cas9介导的Rcan2-1、Rcan2-3突变小鼠模型的建立第68-73页
    · Rcan2-1 Rcan2-3靶点设计第68页
    · 打靶载体的构建及靶点突变效率验证第68-69页
    · 打靶载体的显微注射第69-71页
    · Rcan2-1、Rcan2-3突变类型分析第71-73页
      · Rcan2-1突变小鼠类型第71-72页
      · Rcan2-3突变小鼠类型第72-73页
  · Rcan2-1敲除小鼠、Rcan2-3敲除小鼠的筛选与鉴定第73-76页
    · Rcan2-1敲除小鼠的筛选建系第73页
    · Rcan2-3敲除小鼠的筛选建系第73-74页
    · Rcan2-1敲除小鼠、Rcan2-3敲除小鼠的基因型鉴定第74页
    · Rcan2-1敲除小鼠、Rcan2-3敲除小鼠RNA水平的表达验证第74-75页
    · Rcan2两种剪切变体在RNA水平上的表达量关系第75-76页
  · 高脂肪食物喂养下,Rcan2-1敲除、Rcan2-3敲除对小鼠体重的影响第76-81页
    · 高脂肪食物喂养下,Rcan2-1敲除对小鼠生长和体重的影响第76-78页
    · 高脂肪食物喂养下,Rcan2-3敲除对小鼠生长和体重的影响第78-79页
    · 高脂肪食物喂养下,野生型小鼠、Rcan2-1~(-/-)小鼠、Rcan2-3~(-/-)小鼠的脂肪、肝脏、肾脏的组织形态学分析第79-81页
  · Rcan2-1~(LacZ)、Rcan2-3~(LacZ)小鼠模型的建立及Rcan2-1、Rcan2-3的表达分布第81-90页
    · Rcan2-1~(LacZ)小鼠、Rcan2-3~(LacZ)小鼠的设计策略第81-82页
    · Rcan2-1~(LacZ)小鼠的获得第82-83页
    · Rcan2-3~(LacZ)小鼠的获得第83-84页
    · Rcan2-1~(LacZ)小鼠、Rcan2-3~(LacZ)小鼠的基因型鉴定第84-85页
    · Rcan2-1~(LacZ)小鼠、Rcan2-3~(LacZ)小鼠RNA水平的表达验证第85-86页
    · Rcan2-1~(LacZ)小鼠、Rcan2-3~(LacZ)小鼠中LacZ蛋白的表达情况第86页
    · Rcan2两种剪切变体的表达分布第86-90页
      · Rcan2两种剪切变体在胚胎时期的表达分布第87-88页
      · Rcan2两种剪切变体在成体小鼠中枢神经系统中的表达分布第88-90页
  · Rcan2-1~(FLAG)、Rcan2-3~(FLAG)转基因小鼠的制作与鉴定第90-95页
    · Rcan2-1~(FLAG)、Rcan2-3~(FLAG)转基因小鼠设计与相关载体的构建第90-93页
    · Rcan2-1~(FLAG)、Rcan2-3~(FLAG)转基因小鼠的鉴定第93页
    · Rcan2-1~(FLAG)、Rcan2-3~(FLAG)转基因小鼠FLAG融合蛋白的表达检测第93-95页
5 讨论第95-102页
参考文献第102-110页
致谢第110-111页
攻读硕士研究生期间发表的主要学术论文情况第111-112页
学位论文评阅及答辩情况表第112页

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