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亚洲棉纤维发育关键基因GaHD1上游调控因子解析

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亚洲棉纤维发育关键基因GaHD1上游调控因子解析
论文目录
 
摘要第1-6页
ABSTRACT第6-13页
一 前言第13-25页
  1.1 棉花概述第13-15页
    1.1.1 棉纤维第13-14页
    1.1.2 棉纤维品质第14页
    1.1.3 棉纤维的生长发育第14-15页
  1.2 棉花纤维生长发育的分子调控机理第15-17页
    1.2.1 纤维原始细胞分化与突起相关基因第15-16页
    1.2.2 棉纤维细胞伸长发育相关基因第16页
    1.2.3 棉纤维细胞次生壁合成与增厚期相关基因第16-17页
    1.2.4 棉纤维细胞脱水成熟期相关基因第17页
    1.2.5 棉纤维发育的模式调控途径第17页
  1.3 HD-ZIP转录因子第17-20页
    1.3.1 HD-ZIP Ⅳ转录因子的结构特点第18页
    1.3.2 HD-ZIP Ⅳ基因家族的介绍第18-19页
    1.3.3 HD-ZIP Ⅳ基因家族调控棉花纤维的生长发育第19-20页
  1.4 启动子第20-23页
    1.4.1 启动子概述第20-21页
    1.4.2 启动子研究方法第21-23页
      1.4.2.1 生物信息学分析第21页
      1.4.2.2 缺失突变第21页
      1.4.2.3 定点突变第21页
      1.4.2.4 瞬时表达分析第21-22页
      1.4.2.5 稳定转化分析第22页
      1.4.2.6 酵母单杂交第22-23页
  1.5 SMA-4 突变体第23-25页
二 GaHD1基因启动子的克隆及结构与功能分析第25-46页
  2.1 试验材料第25页
    2.1.1 试验仪器第25页
    2.1.2 实验试剂第25页
    2.1.3 培养基(以 1L为计)第25页
  2.2 GaHD1基因启动子的克隆第25-27页
    2.2.1 亚洲棉4号DNA提取第25-26页
    2.2.2 GaHD1基因启动子全长引物设计第26页
    2.2.3 PCR扩增GaHD1基因启动子全长第26-27页
      2.2.3.1 PCR反应体系第26页
      2.2.3.2 PCR反应条件第26-27页
    2.2.4 PCR产物回收第27页
  2.3 GaHD1基因启动子的Motif分析第27页
  2.4 GaHD1启动子分段克隆第27-28页
    2.4.1 GaHD1启动子分段引物的设计第27-28页
    2.4.2 PCR分段扩增GaHD1启动子序列第28页
    2.4.3 PCR产物回收第28页
  2.5 分段克隆启动子与GUS融合载体的重组及鉴定第28-32页
    2.5.1 pCXSN1262载体的准备第28-29页
      2.5.1.1 pCXSN1262载体第28-29页
      2.5.1.2 pCXSN1262载体的酶切第29页
      2.5.1.3 pCXSN1262载体的胶回收第29页
    2.5.2 目的基因产物与pCXSN1262载体的连接第29-30页
    2.5.3 重组体转化E.Coli第30页
    2.5.4 筛选阳性菌落第30页
    2.5.5 获得重组质粒第30-31页
    2.5.6 GV3101农杆菌感受态的制备第31页
    2.5.7 重组质粒转化GV3101农杆菌第31-32页
  2.6 拟南芥的遗传转化及筛选第32-33页
    2.6.1 拟南芥的种植第32页
    2.6.2 转化拟南芥第32页
    2.6.3 阳性植株的筛选与鉴定第32-33页
    2.6.4 转基因纯合植株的获得第33页
  2.7 转基因拟南芥的GUS组织染色及活性检测第33-35页
    2.7.1 GUS染液的配制第33页
      2.7.1.1 200mL X-Gluc Buffer基液(pH 7.0)的配制第33页
      2.7.1.2 X-Gluc母液的配制第33页
      2.7.1.3 染色液配制第33页
    2.7.2 转基因拟南芥GUS染色第33页
      2.7.2.1 植物组织固定第33页
      2.7.2.2 植物组织染色第33页
      2.7.2.3 植物组织脱色第33页
    2.7.3 GUS相对活性检测第33-35页
      2.7.3.1 溶液配制第34页
      2.7.3.2 标准曲线的制备第34-35页
      2.7.3.3 样品蛋白的提取第35页
      2.7.3.4 样品蛋白含量的测定第35页
      2.7.3.5 GUS酶活性测定第35页
      2.7.3.6 整理所测得的数据,计算GUS酶活性第35页
  2.8 HD1-Pro-full Length转基因拟南芥石蜡切片第35-37页
    2.8.1 实验所需试剂第35页
    2.8.2 植物组织固定第35-36页
    2.8.3 植物组织处理第36页
      2.8.3.1 脱水第36页
      2.8.3.2 透明第36页
      2.8.3.3 浸蜡第36页
      2.8.3.4 包埋第36页
    2.8.4 切片第36页
    2.8.5 粘片第36页
    2.8.6 脱蜡第36-37页
    2.8.7 胶封观察第37页
  2.9 5μM GA3处理转基因拟南芥的GUS组织染色及活性检测第37页
    2.9.1 5μM GA3处理转基因拟南芥第37页
    2.9.2 GUS染液的配制第37页
    2.9.3 转基因拟南芥GUS染色第37页
    2.9.4 GUS相对活性检测第37页
  2.10 结果与分析第37-44页
    2.10.1 GaHD1基因启动子的确定第37页
    2.10.2 GaHD1启动子Motif分析结果第37-38页
    2.10.3 GaHD1启动子分段克隆凝胶检测第38-39页
    2.10.4 pGaHD1:GUS融合表达菌液鉴定第39页
    2.10.5 pGaHD1:GUS融合表达转基因植株鉴定第39-40页
    2.10.6 转基因植株GUS检测第40-41页
    2.10.7 GUS活力检测第41-42页
    2.10.8 HD1-Pro-full Length转基因拟南芥石蜡切片第42页
    2.10.9 5 μM GA3处理后GUS染色结果第42-43页
    2.10.10 5 μM GA3处理后GUS活力检测结果第43-44页
  2.11 小结与讨论第44-46页
三 GaHD1基因上游调控转录因子的体外验证第46-58页
  3.1 试验材料第46-47页
    3.1.1 试验仪器第46页
    3.1.2 试验试剂第46-47页
    3.1.3 培养基第47页
  3.2 试验方法第47-49页
    3.2.1 克隆已知的与棉纤维发育相关的转录调节因子(GaHD1,GaHOX3,GaPDF2,GaMML9)第47页
      3.2.1.1 基因全长引物设计第47页
      3.2.1.2 PCR扩增基因全长第47页
      3.2.1.3 PCR产物回收第47页
    3.2.2 基因全长与克隆载体的连接第47-48页
      3.2.2.1 PCY载体的准备第48页
      3.2.2.2 目的基因产物与PCY载体的连接第48页
    3.2.3 重组载体转化E.Coli第48页
    3.2.4 获得重组质粒第48页
    3.2.5 拟南芥原生质体制备第48-49页
      3.2.5.1 拟南芥种植第49页
      3.2.5.2 制备原生质体第49页
    3.2.6 拟南芥原生质体转化第49页
    3.2.7 GFP标签表达第49页
  3.3 GaHD1启动子的酵母单杂交第49-52页
    3.3.1 pBait-ABAi载体的构建第50页
    3.3.2 重组质粒转化酵母细胞,生成Bait-Reporter酵母菌株第50-51页
      3.3.2.1 线性化酵母单杂交诱饵质粒第50-51页
      3.3.2.2 酵母感受态细胞的制备第51页
      3.3.2.3 pBait-ABAi载体转化酵母感受态细胞第51页
    3.3.3 Bait酵母菌株的自激活检测第51-52页
    3.3.4 酵母感受态制备及转化第52页
      3.3.4.1 酵母感受态制备第52页
      3.3.4.2 酵母感受态转化(载体为pGADT7)第52页
  3.4 结果与分析第52-56页
    3.4.1 棉纤维发育关键基因的克隆第52页
    3.4.2 重组质粒凝胶检测第52-53页
    3.4.3 基因的亚细胞定位第53页
    3.4.4 酵母菌株检测第53-54页
    3.4.5 质粒载体线性化第54页
    3.4.6 酵母转化及筛选结果分析第54-55页
    3.4.7 抗菌素ABAi工作浓度的确定结果分析第55页
    3.4.8 酵母单杂互作结果分析第55-56页
  3.5 小结与讨论第56-58页
四 GaHD1基因上游调控转录因子的体内验证第58-65页
  4.1 试验材料第58页
    4.1.1 试验仪器第58页
    4.1.2 试验试剂第58页
  4.2 烟草瞬时转化第58-61页
    4.2.1 基因全长与克隆载体的连接第58-59页
      4.2.1.1 pCXSN1250载体第58-59页
      4.2.1.2 pCXSN1250的酶切第59页
      4.2.1.3 pCXSN1250载体的胶回收第59页
    4.2.2 重组质粒与pCXSN1250载体的连接第59页
    4.2.3 重组载体转化E.Coli第59页
    4.2.4 获得重组质粒第59页
    4.2.5 重组质粒转化GV3101农杆菌第59-60页
    4.2.6 烟草瞬时转化第60-61页
      4.2.6.1 烟草种植第60页
      4.2.6.2 烟草注射第60-61页
    4.2.7 烟草GUS染色及活力检测第61页
      4.2.7.1 烟草GUS染色第61页
      4.2.7.2 烟草GUS相对活性检测第61页
  4.3 结果与分析第61-63页
    4.3.1 pCXSN1250酶切检测第61页
    4.3.2 阳性农杆菌检测第61-62页
    4.3.3 烟草GUS染色结果第62-63页
    4.3.4 烟草GUS活力检测结果第63页
  4.4 小结与讨论第63-65页
五 总结与展望第65-67页
  5.1 总结第65页
  5.2 研究的创新点第65-66页
  5.3 展望第66-67页
参考文献第67-74页
附录一第74-78页
附录二第78-80页
个人简介第80-81页
致谢第81页

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