论文目录 | |
| 中文摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-9页 |
| 目录 | 第9-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-26页 |
| 1 伪狂犬病病原学及流行特点 | 第14-15页 |
| · 伪狂犬病病毒的主要理化性质 | 第14页 |
| · 伪狂犬病流行特点 | 第14-15页 |
| 2 伪狂犬病病毒分子生物学特性 | 第15-20页 |
| · 伪狂犬病病毒的基因组 | 第15-16页 |
| · 伪狂犬病病毒的主要蛋白及其功能 | 第16-20页 |
| · 伪狂犬病病毒的立即早期蛋白 | 第16页 |
| · 伪狂犬病病毒囊膜糖蛋白的主要种类及功能 | 第16-19页 |
| · 伪狂犬病病毒的主要酶类 | 第19-20页 |
| 3 伪狂犬病的诊断 | 第20-21页 |
| · 病原学诊断技术 | 第20-21页 |
| · 病毒分离鉴定与动物接种 | 第20页 |
| · 核酸探针检测技术 | 第20页 |
| · 聚合酶链式反应(PCR) | 第20-21页 |
| · 基因芯片技术 | 第21页 |
| · 血清学诊断技术 | 第21页 |
| · 血清中和试验(SN) | 第21页 |
| · 酶联免疫吸附试验(ELISA) | 第21页 |
| 4 伪狂犬病的免疫与防治 | 第21-24页 |
| · 伪狂犬病疫苗研究进展 | 第22-24页 |
| · 灭活疫苗 | 第22页 |
| · 弱毒疫苗 | 第22页 |
| · 基因工程苗 | 第22-24页 |
| · 伪狂犬病的预防与控制 | 第24页 |
| 5 研究目的和意义 | 第24-26页 |
| 第二章 伪狂犬病病毒SL株gE基因的克隆与生物信息学分析 | 第26-42页 |
| 1 实验材料 | 第26-28页 |
| · 毒株、细胞、菌株和试剂 | 第26-27页 |
| · 主要溶液配制 | 第27-28页 |
| · 主要仪器 | 第28页 |
| 2 实验方法 | 第28-35页 |
| · PRV病毒的细胞增殖 | 第28-29页 |
| · 病毒基因组DNA的抽提 | 第29页 |
| · 引物的设计与合成 | 第29页 |
| · gE基因的PCR扩增 | 第29-30页 |
| · gE基因PCR产物的TA克隆 | 第30-32页 |
| · 目的片段的回收 | 第30-31页 |
| · 目的片段与pMD19-T Simple克隆载体连接 | 第31页 |
| · 连接产物转化感受态细胞 | 第31-32页 |
| · 重组TA质粒的初步鉴定 | 第32-33页 |
| · 重组菌的培养筛选 | 第32页 |
| · 质粒的小量制备 | 第32页 |
| · 重组质粒的PCR法鉴定 | 第32-33页 |
| · 重组质粒的酶切鉴定 | 第33页 |
| · 核苷酸序列的测定 | 第33页 |
| · gE基因的生物信息学分析 | 第33-35页 |
| · PRV gE基因核苷酸序列分析 | 第33-34页 |
| · PRV gE基因氨基酸序列分析 | 第34-35页 |
| 3 结果与分析 | 第35-40页 |
| · gE基因的PCR扩增 | 第35页 |
| · PRV gE基因TA克隆质粒鉴定 | 第35页 |
| · PRV gE基因序列测定 | 第35页 |
| · PRV gE基因的核苷酸序列分析 | 第35-37页 |
| · PRV gE基因核苷酸序列同源性分析及进化树分析 | 第35-36页 |
| · PRV gE基因核苷酸序列密码子的使用偏爱性 | 第36-37页 |
| · PRV gE基因核苷酸序列的稀有密码子分析 | 第37页 |
| · PRV gE基因核苷酸序列的CpG岛分析 | 第37页 |
| · PRV gE基因的氨基酸序列分析 | 第37-40页 |
| · PRV gE基因氨基酸序列同源性分析及进化树分析 | 第37-38页 |
| · PRV gE蛋白的信号肽分析 | 第38页 |
| · PRV gE蛋白的二级结构预测 | 第38页 |
| · PRV gE蛋白的疏水性分析 | 第38-39页 |
| · PRV gE蛋白的跨膜区分析 | 第39页 |
| · PRV gE蛋白的抗原表位预测 | 第39-40页 |
| 4 讨论 | 第40-42页 |
| 第三章 伪狂犬病病毒gE基因主要抗原表位区的原核表达 | 第42-57页 |
| 1 实验材料 | 第42-43页 |
| · 质粒、菌株和试剂 | 第42页 |
| · 主要溶液配制 | 第42-43页 |
| · 主要仪器 | 第43页 |
| 2 实验方法 | 第43-50页 |
| · gE基因主要抗原表位区TA克隆 | 第43-45页 |
| · 引物的设计与合成 | 第43-44页 |
| · gE基因主要抗原区的PCR扩增 | 第44页 |
| · gE基因主要抗原表位区的TA克隆 | 第44页 |
| · 重组TA克隆质粒的初步鉴定 | 第44-45页 |
| · gE基因主要抗原表位区重组pET-32a(+)表达载体的构建 | 第45-46页 |
| · 目的片段的制备 | 第45页 |
| · 原核表达质粒pET-32a(+)的制备 | 第45-46页 |
| · gE基因主要抗原表位区的定向克隆 | 第46页 |
| · 重组表达菌株的培养及表达 | 第46-47页 |
| · SDS-PAGE电泳检测 | 第47页 |
| · 原核表达条件的优化 | 第47-48页 |
| · IPTG浓度的优化 | 第48页 |
| · 诱导时间的优化 | 第48页 |
| · 诱导温度的优化 | 第48页 |
| · 包涵体提取与纯化 | 第48-49页 |
| · 包涵体的可溶性检测 | 第48页 |
| · 包涵体的粗提 | 第48-49页 |
| · 包涵体的溶解 | 第49页 |
| · 包涵体的复性 | 第49页 |
| · 融合表达产物的免疫印迹(Western-Blot) | 第49-50页 |
| 3 结果与分析 | 第50-55页 |
| · gE基因主要抗原表位区TA克隆质粒的构建 | 第50-51页 |
| · gE基因主要抗原表位区重组pET-32a(+)表达载体的构建 | 第51页 |
| · SDS-PAGE分析gE蛋白主要抗原表位区的表达 | 第51-52页 |
| · gE蛋白主要抗原表位区表达条件的优化 | 第52-54页 |
| · IPTG浓度对gE蛋白主要抗原表位区表达的影响 | 第52-53页 |
| · 不同诱导时间对gE蛋白主要抗原表位区表达的影响 | 第53页 |
| · 不同温度对gE蛋白主要抗原表位区表达的影响 | 第53-54页 |
| · 融合表达产物的免疫印迹分析(Western-Blot) | 第54-55页 |
| 4 讨论 | 第55-57页 |
| 第四章 伪狂犬病病毒gE基因主要抗原表位区间接ELISA检测方法的初步建立 | 第57-67页 |
| 1 实验材料 | 第57-58页 |
| · 抗原的制备及血清 | 第57页 |
| · 主要试剂 | 第57页 |
| · 主要溶液配制 | 第57-58页 |
| · 主要仪器设备及耗材 | 第58页 |
| 2 实验方法 | 第58-61页 |
| · 重组蛋白的大量诱导表达及纯化 | 第58页 |
| · 蛋白含量的测定 | 第58页 |
| · 重组蛋白间接ELISA方法的建立 | 第58-61页 |
| · 抗原最佳包被浓度和抗体最佳稀释度的确定 | 第58-59页 |
| · 反应条件的优化 | 第59-60页 |
| · 特异性试验 | 第60页 |
| · 重复性试验 | 第60-61页 |
| · 与其他试剂盒比较试验 | 第61页 |
| 3 结果与分析 | 第61-65页 |
| · 抗原和抗体最佳稀释浓度的确定 | 第61页 |
| · 反应条件的优化 | 第61-63页 |
| · 血清最适结合时间的确定 | 第61-62页 |
| · 酶标二抗稀释倍数和作用时间的确定 | 第62页 |
| · 底物作用时间的确定 | 第62-63页 |
| · 最适封闭液的确定 | 第63页 |
| · 间接ELISA方法阴阳性临界值的确定 | 第63页 |
| · 特异性试验 | 第63-64页 |
| · 交叉试验 | 第63-64页 |
| · 阻断试验 | 第64页 |
| · 重复性试验 | 第64-65页 |
| · 批内重复 | 第64-65页 |
| · 批间重复 | 第65页 |
| · 与标准试剂盒抗体检测结果比较 | 第65页 |
| 4 讨论 | 第65-67页 |
| 全文总结 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-75页 |
| 致谢 | 第75-76页 |
| 附录一 | 第76
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