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PRRSV N基因的原核表达、蛋白纯化及间接ELISA方法的初建

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PRRSV N基因的原核表达、蛋白纯化及间接ELISA方法的初建
论文目录
 
中文摘要第1-6页
ABSTRACT第6-8页
缩略词表第8-14页
第一章 PRRSV综述第14-30页
  1 PRRSV研究进展第14-29页
    · PRRS简述第14-15页
    · PRRSV病原学特性第15-16页
      · 病原分类第15页
      · PRRSV形态特征第15页
      · 病毒的理化性质第15页
      · PRRSV的体外培养特性第15-16页
      · 病毒的血凝特性第16页
    · PRRSV基因组结构第16-17页
    · PRRSV编码蛋白及功能第17-18页
      · 非结构蛋白第17页
      · 结构蛋白第17-18页
    · 猪繁殖与呼吸综合征的流行病学第18-19页
      · 宿主因素第18页
      · 病毒因素第18-19页
      · 疫苗因素第19页
      · 饲养管理与环境因素的影响第19页
    · 猪繁殖与呼吸综合征的免疫学研究进展第19-21页
      · PRRSV致病机理第19-20页
      · 体液免疫第20页
      · 细胞免疫第20-21页
    · 猪繁殖与呼吸综合征诊断方法研究进展第21-26页
      · 临床症状第21页
      · 病理诊断第21-22页
      · 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原检测技术第22-24页
        · 病毒分离第22页
        · 单克隆抗体技术第22页
        · 免疫胶体金技术第22-23页
        · 原位杂交技术第23页
        · RT-RCR技术第23-24页
        · 荧光定量PCR(Fluorogenetic quantitative PCR,FQ-PCR)第24页
        · LAMP(Loop-mediated isothermal amplification,环介导等温扩增)第24页
      · 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测技术第24-26页
        · 免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)第24-25页
        · 间接免疫荧光抗体技术(IFA)第25页
        · 血清中和试验(SN)检测第25页
        · 酶联免疫吸附试验(ELISA)第25页
        · 免疫胶体金技术第25-26页
    · PRRSV疫苗第26-28页
    · 综合措施第28-29页
      · 加强饲养管理第28页
      · 建立生物安全制度第28页
      · 合理免疫及定期监测第28-29页
  2 本研究的目的与意义第29-30页
第二章 PRRSV CH-1R株N基因的克隆与生物信息学分析第30-51页
  1 实验材料第30-31页
    · 毒株第30页
    · 菌株第30页
    · 试剂第30-31页
    · 溶液配制第31页
    · 仪器设备第31页
  2 试验方法第31-38页
    · PRRSV总RNA的制备第31-32页
    · PRRSV N基因的RT-PCR扩增第32-33页
      · N基因引物的设计与合成第32页
      · RNA的反转录第32-33页
      · PCR扩增及电泳检测第33页
    · N基因的TA克隆第33-36页
      · 目的片段的回收第33-34页
      · N基因与T载体的连接第34页
      · 氯化钙法制备DH5α感受态细胞第34-35页
      · 重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞第35页
      · 重组质粒的鉴定第35-36页
        · 重组菌的培养第35页
        · 重组质粒DNA的提取第35-36页
        · 重组pMD-N质粒的PCR鉴定第36页
        · 重组pMD-N质粒的双酶切鉴定第36页
        · 核苷酸的序列测定第36页
    · N基因的生物信息学分析第36-38页
      · PRRSV N基因核苷酸序列分析第36-37页
        · 核苷酸多序列分析第36-37页
        · CpG岛分析第37页
        · 密码子使用偏爱性分析第37页
        · 稀有密码子分析第37页
      · PRRSV N基因氨基酸序列分析第37-38页
        · 氨基酸多序列分析第37页
        · 二级结构分析第37页
        · 亲疏水性分析第37页
        · 跨膜区分析第37-38页
        · 抗原位点预测分析第38页
        · 信号肽分析第38页
  3 结果与分析第38-49页
    · N基因的PCR扩增第38页
    · 重组质粒pMD-N鉴定第38页
    · PRRSV N基因测序结果第38-40页
    · PRRSV N基因的核苷酸序列分析第40-45页
      · 多序列对比第40-43页
      · 核苷酸序列同源性及进化树分析第43-44页
      · CpG岛分析第44页
      · 密码子使用偏爱性分析第44页
      · 稀有密码子分析第44-45页
    · PRRSV N基因氨基酸序列分析第45-49页
      · 氨基酸多序列分析第45-47页
      · 二级结构分析第47-48页
      · 亲疏水性分析第48页
      · 跨膜区分析第48页
      · PRRSV N基因推导的氨基酸序列抗原位点预测分析第48-49页
      · 信号肽分析第49页
  4 讨论第49-51页
第三章 PRRSV CH-1R株N基因的原核 69/1/wz1518968.htm8表达第51-64页
  1 材料第51-53页
    · 菌株第51页
    · 载体第51页
    · 质粒第51页
    · 试剂第51页
    · 溶液配制第51-53页
    · 仪器第53页
  2 试验方法第53-57页
    · 目的片段的制备第53页
    · pET-32a(+)的制备第53-54页
    · PET-N的构建第54页
    · PET-N转化DH5α及鉴定第54-55页
    · PET-N转化E.coli Rosetta(DE3)及鉴定第55页
    · 重组表达菌的诱导表达第55-56页
      · IPTG浓度的优化第55页
      · 诱导时间的优化第55-56页
      · 诱导温度的优化第56页
    · 融合表达蛋白的SDS-PAGE电泳检测第56-57页
    · 重组表达蛋白的可溶性检测第57页
    · 重组表达蛋白的Western-blot鉴定第57页
  3 结果与分析第57-62页
    · 重组质粒pET-N的构建第57-58页
    · SDS-PAGE检测重组表达蛋白第58页
    · N蛋白表达条件的优化第58-60页
      · IPTG浓度优化第58-59页
      · 不同诱导时间优化第59-60页
      · 不同温度优化第60页
    · 重组表达蛋白的可溶性检测第60-61页
    · 融合表达产物的反应原性(Western-Blot)第61-62页
  4 讨论第62-64页
第四章 PRRSV CH1-R株N蛋白表达纯化及间接ELISA检测方法的初步建立第64-78页
  1 实验材料第64-66页
    · 质粒第64页
    · 血清第64页
    · 试剂第64-65页
    · 溶液配制第65页
    · 仪器及耗材第65-66页
  2 试验方法第66-69页
    · 重组蛋白的表达及纯化第66页
      · 重组蛋白制备第66页
      · PRRSV重组N蛋白的纯化第66页
    · 蛋白含量的测定第66-67页
    · PRRSV N-ELISA的初步建立第67-68页
      · 抗原抗体最佳反应条件的测定第67页
      · 最适封闭液的确定第67-68页
      · 血清作用时间的确定第68页
      · 酶标二抗稀释倍数和作用时间的试验第68页
      · 底物反应时间的确定第68页
      · 血清阴阳性的判定第68页
    · 特异性试验第68-69页
      · 交叉试验第68-69页
      · 阻断试验第69页
    · 重复性试验第69页
      · 批内重复第69页
      · 批间重复第69页
    · 与商业化试剂盒对比第69页
  3 结果与分析第69-75页
    · PRRSV重组N蛋白的纯化第69-70页
    · 抗原和抗体最佳稀释浓度的确定第70-71页
    · 最适封闭液的确定第71页
    · 血清最适结合时间的确定第71-72页
    · 酶标二抗最佳作用条件的确定第72页
    · 底物反应时间的确定第72-73页
    · 血清阴阳性判定第73页
    · 特异性试验第73-74页
      · 交叉试验第73页
      · 阻断试验第73-74页
    · 重复性试验第74-75页
      · 批内重复第74页
      · 批间重复第74-75页
    · 与标准试剂盒抗体检测结果比较第75页
  4 讨论第75-78页
全文总结第78-79页
创新点第79-80页
参考文献第80-86页
致谢第86 页

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